白骨壤內生細菌的多樣性及其抑菌活性分析

倪 婕，李 菲，李雨霖，陸 璐，3，謝一嘉，劉小玲，余 煉*

(1.廣西大學輕工與食品工程學院，廣西 南寧 530004；2.廣西科學院/廣西近海海洋環境科學重點實驗室，廣西 南寧 530007；3.廣西科學院廣西海洋天然產物與組合生物合成化學重點實驗室培育基地，廣西 南寧 530007)

【研究意義】紅樹林(Mangrove)分布于熱帶和亞熱帶地區，是一種處于海洋和陸地過渡帶的特殊生態系統，包括紅樹植物、細菌、真菌、微藻、鳥類、無脊椎動物和哺乳動物等類群[1]。該生境的紅樹植物頻繁遭受潮汐淹沒和強紫外線照射，致使其根部處于間歇性缺氧狀態[2]。其中，內生菌作為紅樹植物的重要組成部分，其種類豐富且數量龐大，在長期抵抗海洋高溫、高鹽、強風、缺氧和強紫外線等惡劣條件的過程中，其遺傳物質得到不斷適應和進化[3]，因而相比于陸生來源的微生物，其產生的代謝產物結構特殊、抗菌作用機制新穎，是新型海洋藥用先導化合物的重要來源[4]。白骨壤(Avicenniamarina)又名海欖雌，為馬鞭草科灌木或小喬木，具有細棒狀的出水呼吸根，是紅樹林的優勢樹種；葉片近無柄，革質，呈黃綠色；果實為渾圓心形，俗稱“欖錢”[5]，具有根系發達、生長快速、對惡劣環境適應性強等特點，富含可產生抗生素、防腐劑和酶等活性物質的內生菌[6]。白骨壤作為藥用植物資源，可用于治療瘧疾、風濕、哮喘、天花和潰瘍等多種疾病[7]，藥理學實驗顯示，其所含的二萜類、環烯醚萜和萘醌類等化合物具有改善癌癥、糖尿病、炎癥、腹瀉及氧化應激等疾病的藥物特性[8]。白骨壤的內生細菌與植物體互利共生，能產生與宿主相同的信號傳導通路，合成與宿主類似的活性次生產物，這些產物具有抑制植物病原菌[9]、抗衰老[10]及殺蟲[11]等功效。然而，目前鮮見對白骨壤各部位內生細菌進行系統分離鑒定的報道，其抑菌活性方面的用途也未得到充分發掘。因此，勘探白骨壤內生細菌的多樣性及其生物學活性，對促進紅樹林微生物資源的開發和應用具有重要意義。【前人研究進展】靳鵬飛等[12]首次從白骨壤中分離到32株絲狀內生真菌，其中有6株能顯著抑制金黃色葡萄球菌。陳振明等[9]從白骨壤中獲得13株內生細菌，其中9株對黃瓜枯萎病菌具有拮抗作用。Viswanath等[13]從白骨壤根際分離到約800株細菌，其中55 %能分泌群體感應信號分子AHL進行群體交流和協調。Ali等[14]從白骨壤中分離出28株內生細菌，其中有2株能顯著提高植物的鹽堿耐受性。Jiang等[15]對白骨壤各部位進行放線菌分離篩選，共得到10株至少對1種ESKAPE病原體具有抑制作用的放線菌。李蜜等[11]從白骨壤中分離到14株內生細菌，其中的Stenotrophomonasrhizophila具有延緩線蟲衰老能力。可見，紅樹植物白骨壤的內生菌具有豐富且獨特的物種多樣性，對研究和應用其活性化合物資源意義重大。目前，將16S rRNA基因序列分析用于細菌分類和鑒定的研究越來越多，如：李飛娜等[16]從桐花樹、老鼠簕和秋茄等12種植物中共獲得192株內生放線菌，經16S rRNA基因序列分析，其潛在新種共有22株，放線菌資源新穎性高；江蕾等[17]對分離自海黃瓜的34株共附生細菌進行16S rRNA基因序列鑒定，結果發現這些細菌隸屬于18科24屬；李小群等[18]從海芒果及其根際土壤中共分離得到15株可培養細菌，經16S rRNA基因序列分析，發現其分屬于厚壁菌門和放線菌門的發育類群。可見，16S rRNA基因序列分析已成為微生物多樣性研究的重要工具。【本研究切入點】廣西北侖河的白骨壤內生細菌具有產生豐富活性代謝物質的潛能，但目前針對該海域白骨壤各部位內生細菌多樣性及其抑菌活性的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】結合16S rRNA基因序列分析系統地研究白骨壤各部位可培養內生細菌的多樣性，并分析這些內生細菌次生代謝產物的抑菌活性，為充分利用紅樹植物內生細菌資源和開發安全、高效的海洋藥物前體化合物提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 白骨壤樣品 優勢樹種白骨壤的根、皮、葉、花和果實樣品采集于廣西北部灣北侖河口紅樹林保護區(東經108°16′30″，北緯21°35′00″)，置于無菌封口袋4 ℃保存。

1.1.2 培養基 參考李小群等[18]、李菲等[19]的方法采用AGG、M4、M5、M7、M9、M10、M11、ISP2、ISP3、ISP7和PDA等11種分離培養基對白骨壤內生細菌進行分離，其中發酵培養基為ISP2液體培養基。

1.1.3 菌株 指示菌啤酒酵母菌(SaccharomycescerevisiaeCICC 33032)、黑曲霉(AspergillusnigerCICC 2487)、擴展青霉(PenicilliumexpansumCICC 40658)、枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisCICC 20612)和埃希氏大腸桿菌(EscherichiacoliCICC 23657)由廣西大學輕工與食品工程學院微生物實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌分離純化及保藏 將完整無病害的白骨壤果實、花和葉等組織依次浸泡于0.5 %次氯酸鈉溶液和消毒酒精中滅菌各3 min，最后用無菌水沖洗3次，取1.0 g樣品與1.0 mL無菌水混合，經組織研磨器研磨后，采用梯度稀釋法處理勻漿，各取0.2 mL 10-2和10-3稀釋度的樣液用涂布棒涂布均勻，多數菌落在28 ℃條件下培養3～5 d長出，此時可進行計數和分離。純化后的菌株以20 %(W/V)甘油為保藏劑，置于-80 ℃長期凍存。

1.2.2 16S rRNA基因序列鑒定 以27F和1492R為引物，采用Chelex-100法[20]提取白骨壤內生菌株的總DNA作為PCR模板，PCR反應體系和條件參考李菲等[1]的方法。通過瓊脂糖凝膠電泳驗證目標條帶后，委托北京擎科新業生物技術有限公司對擴增成功的PCR產物進行測序。采用BioEdit軟件對測序結果進行編輯整理后，將序列導入數據庫EzBioCloud(https://www. ezbiocloud. net/)在線比對和進行Clustal X多重比較。選擇與測序菌株同源性最高的菌種序列，利用MEGA 5.0和鄰位歸并法進行聚類分析，構建系統發育進化樹以推斷進化關系[21]。

1.2.3 菌株發酵及次級代謝產物提取 采用裝有200 mL液體培養基的500 mL錐形瓶制備發酵液，滅菌后接入1環對數生長期的菌體，在180 r/min、30 ℃恒溫搖床中培養7 d等待代謝產物充分產生。經冷凍離心后棄菌體，用1∶1(V/V)乙酸乙酯充分萃取，于43 ℃的旋轉蒸發器中減壓濃縮。依次用少量乙酸乙酯、氯仿、丙酮、甲醇和石油醚將次級代謝產物溶出，利用通風櫥揮發至干，最后用2.0 mL DMSO溶液溶解備用。

1.2.4 菌株抑菌活性試驗 采用牛津杯法[22]測定分離菌株對1.1.3中5種指示菌的抑菌活性。將檢測菌濃度調至105～106CFU/mL制備檢測平板。每個牛津杯添加80.0 μl內生細菌的次級代謝產物，以DMSO溶液為空白對照，在28 ℃下培養，待指示菌長出覆蓋平板后測量抑菌圈直徑。參考覃媚等[23]的標準判斷抑菌活性的強(抑菌圈直徑≥20 mm)、中等(抑菌圈直徑10～20 mm)和弱(抑菌圈直徑6～10 mm)。

2 結果與分析

2.1 內生細菌的多樣性分析結果

根據菌落的顏色、形態、大小及生長時間等特征，在白骨壤的果實、根、皮、葉和花5個部位中共分離出61株細菌，隸屬于3門4綱12目16科20屬36種，其中，α-變形菌綱和γ-變形菌綱各8株，各占總菌株數的22.22 %；芽孢桿菌門8株，占總菌株數的22.22 %；放線菌門12株，占總菌株數的33.33 %，其中放線菌包括8個屬，分別為鏈霉菌屬、微單孢菌屬、角桿菌屬、假動球菌屬、棒狀桿菌屬、Sinomonassp.、微桿菌屬和戈登氏菌屬(表1)。說明放線菌是白骨壤內生細菌的優勢類群。

表1 白骨壤內生細菌的組成

根據鑒定出的36株內生細菌16S rRNA基因序列，選擇與其最相似的參比菌株構建N-J系統發育進化樹。從圖1可看出，菌株YA080與腸桿菌科的有效發表菌株PantoeaanthophilaLMG 2558T的相似率最低，為94.59 %；YA348與橙單胞菌科的有效發表菌株AurantimonascoralicidaDSM 14790T的相似率次之，為94.97 %。此外，菌株YA130與ThioclavapacificaDSM 10166T、YA204與SphingomonasaquatilisJSS7T、YA217與CorynebacteriumvariabileDSM 20132T、YA252與CorynebacteriumterpenotabidumDSM 20132T、YA265與SinomonassoliCW 59T及YA274與GordoniaterraeNBRC 100016T的相似度分別為95.93 %、96.05 %、96.95 %、97.01 %、97.90 %和96.47 %。以上8株菌株與模式菌的相似度低于98.65 %[24]，與各自所在菌科中序列相似的菌株在N-J系統發育進化樹上聚類為一簇。可見，該8株菌株是其所在菌科中潛在的新分類單元，本研究中白骨壤的內生細菌潛在新種率為22.22 %，且多為放線菌門，包括棒狀桿菌屬、Sinomonassp.和戈登氏菌屬。

圖1 白骨壤內生細菌的N-J系統發育進化樹Fig.1 Neighbor-Joining tree of endophytic bacteria in A. marina

2.2 內生細菌在各分離培養基及各組織部位的分布情況

從屬的水平對白骨壤花、果實、根、葉和皮的內生細菌進行韋恩圖(圖2)分析，結果從各組織部位中均分離到Bacillussp.菌株，從花、皮和根中均分離到Pseudomonassp.菌株，從花和果實中均分離到Stakelamasp.和Acinetobactersp.菌株，從花和皮中均分離到Pantoeasp.和Mangrovibactersp.菌株，從果實和皮中均分離到Stakelamasp.菌株，從花和葉中均分離到Corynebacteriumsp.菌株。從圖2還可看出，從白骨壤各組織分離到的內生細菌種屬數量排序為果實>花>皮>根=葉，在果實部位的內生細菌屬最多，共10個屬，占總屬數的50.00 %，花次之，有9個屬，其后皮有7個屬，葉和根各有2個屬。說明在白骨壤的不同組織中，其內生細菌的數量及種屬存在差異。

從圖3可看出，從不同培養基分離得到的種屬數與菌株數呈正比，獲得細菌數量較多的培養基其種屬數也較豐富。其中，AGG(改良高氏培養基)中內生細菌的多樣性最豐富，共分離到8個菌屬，可作為分離培養基；從M11(棉子糖-組氨酸培養基)中分離到的菌株最少，僅1株。說明由不同培養基分離得到的白骨壤內生細菌種屬數量有所不同。

2.3 白骨壤內生細菌的抑菌活性分析結果

由表2可知，36株細菌均至少對1種病原菌具有抑制能力，其中，芽孢桿菌屬菌株YA001和YA304、鞘氨醇單胞菌屬YA257、假單胞菌屬YA265對5種病原菌具有抑菌活性；共有25株細菌對大腸桿菌具有抑菌活性，占總菌株數的69.44 %，尤其以YA350、YA304和YA124的次級代謝產物對大腸桿菌的抑制能力更強；枯草芽孢桿菌的活性菌株有28株，占總菌株數的77.78 %，尤其以YA350對枯草芽孢桿菌的抑制效果最佳；啤酒酵母的活性菌株有29株，占總菌株數的80.56 %；有26株細菌對擴展青霉菌有抑制活性，占總菌株數的72.22 %，尤其以YA350的抑菌圈直徑達30.2 mm，在所有菌株中抑菌活性最明顯；有19株細菌對黑曲霉菌具有抑菌活性，占總菌株數的52.78 %，且從白骨壤中獲得的芽孢桿菌對黑曲霉均有抑制效果。說明白骨壤的部分內生細菌對病原真菌和細菌具有較強的抑菌活性。

圖2 白骨壤各組織中內生細菌屬級群類分布韋恩圖Fig.2 Venny of endophytic bacteria genera in A. marina

3 討 論

我國于2000年建立了廣西北部灣北侖河口國家級自然保護區，該區域擁有河口和海域等多種類型的海岸地貌，平均氣溫、降水量和土壤鹽分均適宜各物種生長繁殖，在遺傳結構、物種組成和生態系統穩定性等方面具有其他海區無法比擬的優勢，也因此蘊育了豐富的生物多樣性[25]。本研究從該地區的紅樹植物白骨壤組織中共分離到36株細菌，隸屬于3門4綱12目16科20屬36種，其中，屬于放線菌的有8個屬12株，是最優勢類群，與Genilloud[26]研究指出產生生物活性物質的菌株中有約45 %是放線菌的觀點相似，說明白骨壤中的內生放線菌資源豐富，產生生物活性物質的潛力巨大。在新穎性方面，本研究從北侖河口的紅樹植物白骨壤中共得到8株潛在新種，且多來自放線菌門，均勻分布于果實、花、葉和皮中，新種率為22.22 %，高于李菲等[1]從無瓣海桑中獲得菌株的潛在新種率(13.2 %)和李家怡等[27]從紅海欖中分離所得菌株的潛在新種率(17.6 %)，可能與白骨壤新陳代謝較快及耐鹽和耐淹水能力較強[28]有關，說明宿主對環境的高適應能力更有利于孕育豐富的物種。

圖3 不同培養基分離得到的白骨壤內生細菌數對比Fig.3 Endophytic bacteria numbers of A. marina isolated from different media

表2 36株白骨壤內生細菌對5種指示菌的抑菌活性

本研究結果表明，從白骨壤的果實、花、根、皮和葉組織中均分離到Bacillussp.菌株，與Divya等[29]研究認為芽孢桿菌具有易于生長及能適應各種環境等特點的觀點一致；從白骨壤分離得到的內生細菌在果實和花中分布居多，在根和葉中占少數，與李蜜等[10]、李菲等[1]、李家怡等[27]的研究結果存在較大差異，表明內生菌的多樣性與宿主植物所處的季節、地理方位和生存環境等有關[30]，也表明內生菌會隨著植株的生長發育將種子及根際中的內生菌垂直轉移到花和果實中[31]。本研究的采樣時間在8月，此時正值白骨壤的盛果期，果實內部的微生物得到充足的營養物質從而大量生長繁殖，可能是果實和花中的內生菌數量多于根、皮等部位的原因之一。此外，成熟期時果實的水分逐步流失、淀粉大量積累，使得該部位產生的內生菌通常能耐受高滲透壓，具有淀粉酶活性[32]；在11種分離培養基中，AGG培養基最具優勢，共分離到8個菌屬且多為放線菌，可作為分離內生細菌的首選培養基，與李菲等[19]的研究結論一致。

在本研究的抑菌試驗中，36株細菌均至少對1種指示菌株具有抑制活性，其中有4株菌表現出廣譜抑菌活性，說明從白骨壤內生細菌中分離出活性突出的次級代謝產物潛力巨大。其中，YA304和YA350的抑菌能力最突出，二者分別與BacillussiamensisKCTC13613T和MicromonosporawenchangensisCCTCCAA2012002T的相似性最高。Jeong等[33]發現暹羅芽孢桿菌KCTC13613T能顯著抑制植物病原真菌立枯絲核菌和灰葡萄孢菌，且對革蘭氏陽性菌黃體微球菌也有較強的抗菌活性。本研究分離到的暹羅芽孢桿菌YA304對大腸桿菌具有強抑制效果，對啤酒酵母、擴展青霉菌、枯草芽孢桿菌和黑曲霉則有中等抑菌效果，進一步豐富了對Bacillussiamensis菌株抑菌活性的認識；文昌小單胞菌YA350對擴展青霉的抑菌圈直徑達30.2 mm，活性最高，具有開發為天然殺菌劑和成為水果采后青霉病生防菌株的巨大潛力。Takahashi和Omura[34]研究指出，新物種中出現新型活性化合物的潛力相對較大，本研究8株潛在新種均至少對3種指示菌表現出抑制效果，與Takahashi和Omura[34]的研究結果吻合。

4 結 論

從白骨壤的果實、花、皮、根和葉部位分離得到的內生細菌多樣性較豐富，潛在新種率較高，且部分菌株具有廣譜抑菌活性，可作為開發新型生物活性化合物的重要來源。