生物農藥與生物質發酵肥對煙草根結線蟲病害防控效果研究

黃 坤，余 萍，闕勁松，羅紅梅，劉春明，陳麗華，張紹松*

(1.云南省煙草公司紅河州公司，云南 彌勒 652399；2.云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所/農業農村部西南作物基因資源與種質創制重點實驗室/云南省農業生物技術重點實驗室，云南 昆明 650205)

【研究意義】煙草生產過程中常出現多種病害，根結線蟲(Root-knot nematode)病是最重要病害之一[1]。根據2002年我國煙草業統計，全國根結線蟲病害發生面積為10.83萬hm2，直接危害造成的煙葉經濟損失7917.84萬元，占侵染性病害所致損失的5.7 %[2]。該屬的南方根結線蟲(Meloidogyneincognita)寄主范圍廣[3]。因根結線蟲危害給煙草生產造成重大經濟損失，防控該病害備受關注，研究具有安全、環境友好型、資源良性循環的高效防控策略和技術措施，對增加煙農的收入、提升煙葉質量和改善生態環境均具有重要意義。【前人研究進展】根結線蟲主要危害作物的根部，給防治帶來困難[4]。早期曾使用溴甲烷[5]、棉隆(Dazomet)[6-7]、涕滅威(Carbanolate,Temik)[8]等對根結線蟲進行防治，雖效果良好，但這類化學農藥對人、畜和環境危害大[5-8]，近幾年已禁用或限制使用。應用生物農藥防控根結線蟲病害是備受關注的熱點領域，自發現阿維菌素 (Avermectins)具有殺線蟲活性[9-11]后，近年來，又發現生物堿對根結線蟲具有毒殺活性[12]。蘇云金芽孢桿菌[13]、厚孢輪枝菌[14]、及淡紫擬青霉[15]等細菌、放線菌與真菌對根結線蟲的殺蟲活性。利用細菌、放線菌或真菌的活體細胞及其代謝產物、植物活性成分進行根結線蟲病害的防控是現代農業的發展趨勢。有關病原根結線蟲方面，作者曾開展了根結線蟲分離和苗期接種方法的探索[16]；病原根結線蟲的染色方法研究[17]；煙苗移栽初期病原根結線蟲侵入寄主根系組織的檢測等[18]。【本研究切入點】在開展煙草根結線蟲病害防控研究的基礎上，結合紅河煙區根結線蟲發生的特點，在關鍵時期，選用防控效果較好的3種生物農藥，配合施用生物質發酵肥，采取生物農藥、生物質發酵肥與施藥關鍵時期相結合的綠色綜合防控策略。【擬解決的關鍵問題】研究總結出一套生物農藥與生物質發酵肥科學配施、選準施用時期與劑量，建立具有顯著效果的綠色綜合防控策略與技術措施。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

2018年4-12月在云南省紅河州建水縣臨安鎮明哨村和云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所內進行試驗。

1.2 供試材料

1.2.1 煙草種子與煙苗 煙草(NicotianatabacumLinn)品種：煙草品種為云煙87。田間試驗的種子、煙苗培育及其處理由紅河州煙草公司建水縣分公司南莊煙站提供與實施。

1.2.2 復混肥料 復混肥料屬于煙草專用肥，總養分≥45 %(含硝態氮)，N-P2O5-K2O=18-5-25，云南省紅河恒林化工有限公司產品。

1.2.3 生物農藥 25 %丁硫甲維鹽(濰坊萬勝生物農藥有限公司產品)，水乳劑，總有效成分含量25 %，丁硫克百威含量23 %；甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽含量2 %。肯邦線尊(泰安市泰山現代農業科技有限公司產品)，顆粒劑，阿維菌素有效成分含量0.5 %，低毒。厚孢輪枝菌(云南微態源生物科技有限公司產品)，微粒劑，有效成分含量2.5億個孢子/g。

1.2.4 生物質發酵肥 苕子秸稈發酵肥、萬壽菊秸稈發酵肥、油蘿卜綠色秸稈發酵肥和中藥渣發酵肥均由課題組、紅河州煙草公司和云南千州生物有機肥有限公司共同研發，利用生物質秸稈或殘渣添加菌劑發酵制備而成(試制品)。

1.2.5 儀器與分樣篩 解剖鏡和顯微鏡：Olympus SZX10解剖鏡、Olympus BX51光學顯微鏡；分樣篩：20、100和600目共3種孔徑分樣篩。

1.3 試驗設計

試驗共設8個處理：處理1(CK)，施用復混肥料45 g/株，不施用其它有機肥和防控根結線蟲病害的農藥；處理2，育苗末期漂池中施用丁硫甲維鹽0.077 g/株，移栽前塘施丁硫甲維鹽0.18 g/株(1.8 mg/mL溶液100 mL)和油蘿卜綠色秸稈發酵肥36 g/株，配施復混肥32 g/株；處理3，育苗末期漂池中施用肯邦線尊0.309 g/株，移栽前塘施肯邦線尊1.36 g/株(按重復小區180株，稱取244.8 g，與砂土8755.8 g混勻，塘施含農藥砂土50 g/株)和油蘿卜綠色秸稈發酵肥36 g/株，配施復混肥32g/株，煙株團棵期揭膜前再次塘施0.909 g/株；處理4，育苗末期漂池中施用丁硫甲維鹽0.077 g/株，移栽前塘施厚胞輪枝菌0.909 g/株(按重復小區180株，稱取163.6 g，與砂土8836.4 g混勻，塘施含農藥砂土50 g/株)和油蘿卜綠色秸稈發酵肥36 g/株，配施復混肥32 g/株，煙株團課期揭膜前再次塘施0.909 g/株；處理5，移栽前塘施苕子秸稈發酵肥36g/株，配施復混肥32 g/株；處理6，移栽前塘施萬壽菊秸稈發酵肥36 g/株，配施復混肥32 g/株；處理7，移栽前塘施油蘿卜綠色秸稈發酵肥36 g/株，配施復混肥32 g/株；處理8，移栽前塘施中藥渣發酵肥36 g/株，配施復混肥32 g/株。每處理設3個重復小區，每個小區種植60株煙，株行距為0.40 m×1.10 m，試驗區的四周留出2～3株或2～3墑作為保護行。與對照相比，各處理的復混肥料施用量為32 g/株，減少28.9 %。

1.4 試驗方法

1.4.1 煙苗培育與移栽后管理 煙苗培育采用漂浮育苗技術，建水縣分公司南莊煙站育苗點培育。采用烤煙小苗膜下移栽技術，煙苗移栽后，其它措施按烤煙小苗膜下移栽技術規程進行管理。試驗小區煙株不同生長階段的管理，按烤煙大田種植技術措施進行管理。

1.4.2 煙田根際土壤取樣 取樣時間：分別在移栽前、移栽后45、90 d和采烤結束4個時期，采集根際土壤樣品共4次。取樣方法：每重復小區選第15、30和45株煙，共采集3株煙的根際土壤，距煙株15 cm，向下20 cm取土約400 mL(下一次取土樣在煙株另一側，交替取樣)根際土壤，裝入取樣袋，分別記錄試驗地點、取樣時間、處理編號和重復小區煙株編號等。

1.4.3 煙株根際土壤二齡幼蟲(J2)檢測 采集每個重復小區3株煙的根際土壤，在實驗室從個土壤樣品中及時量取樣品50 mL并將其混勻，取出混勻土樣50 mL。土壤中J2數量檢測方法同文獻[16]，采用高滲蔗糖溶液分離與分樣篩分離相結合的分離方法，并在解剖鏡下測定每個土壤樣品單位體積(50 mL)中J2數量。

1.4.4 煙田根際土壤主要養分檢測 團棵期采集的土壤樣品，以每個小區3株煙的等體積根際土壤的混合樣品作為小區土樣，將樣品送至云南耘耨科技有限公司檢測。檢測土壤pH值(NY/T1377-2007)，有機質(NY/T1121.6-2006)，全氮(NY/T1121.24-2012)，水解性氮(LY/T1228.6-2015)，有效磷(NY/T1121.7-2014)和速效氮(NY/T889.6-2004)等6項指標。

1.4.5 煙葉采烤、分級、產量與產值測定 按煙葉采收、烘烤與分級管理要求進行。采烤完畢，稱量每個重復小區不同等級的煙葉重量，并按當年收購價計算每個小區的產值。每個小區種植了60株煙，在煙株生長過程中，個別煙株因多種緣由死亡，以最終采烤煙株的數量，計算出小區內單株煙的平均產量與產值，進而折算為公頃產量與產值。

1.4.6 采烤煙葉結束后挖根調查病害危害程度 采烤煙葉結束，按“中華人民共和國國家標準GB/T23222-2008”中煙草病蟲害分級及調查方法，采用煙草根結線蟲病害地下部分分級與病情指數調查方法。及時挖出盡可能完整的煙株根系，當天調查每個試驗小區中每株煙的根系受根結線蟲危害的病級，詳細記錄并計算試驗小區煙株的病級與小區病情指數。

病情指數 =

采用不同藥劑或生物質有機肥料的處理，與空白對照(CK)相比，即為某種處理的相對防效。

某種處理的相對防效(%)=

2 結果與分析

2.1 煙株根際土壤單位體積中2齡幼蟲的數量檢測

烤煙移栽前后不同時期4次采集的根際土壤，采用高滲蔗糖溶液離心與分樣篩分離相結合的方法，檢測單位體積根際土壤中J2數量，結果如圖1所示。通過對所檢測的50 mL根際土壤中J2數量的數據進行方差分析，試驗中8個處理的4次采樣檢測，其中，第1次采樣(F=1.60F0.01=4.28，處理間差異達及極顯著水平。第3次采樣的檢測結果方差分析顯示，處理間差異達顯著水平，F=2.77>F0.05=2.76。

根據方差分析結果，試驗中第1次取樣檢測的各處理間根際土壤中J2數量差異不顯著，總體的根際土壤中J2數量都較少(10～35條/50 mL土)，此時，只是劃定試驗小區，未對試驗地進行任何施藥與施肥處理，測定的J2數量只是試驗地的背景值。但是，測定數據顯示，試驗地的土壤中含有J2，各處理與小區間的土壤中J2數量不均一，只是未達到顯著差異。該結果提示，試驗地在上年度種植烤煙發生根結線蟲病害，本次試驗所檢測的J2中可能含有根結線蟲的幼蟲。第2次采樣的檢測結果顯示各處理間差異達極顯著水平，單位體積根際土壤中J2數量總體較低(4～29條/50 mL土)，比移栽煙苗前的背景值低，同時，出現未作任何處理的空白對照最低，而藥劑或施生物質發酵肥處理卻較高的現象，分析認為，由于處理1(CK)未施藥或施發酵肥，較多的J2已侵入煙株根系，故所檢測到的單位體積根際土壤中J2數量較低。施藥與施肥的不同處理間， J2侵染進程受到影響，單位體積根際土壤中J2數量相對較高。第3次采樣的檢測結果，各處理間差異達顯著水平，且總體的單位體積根際土壤中J2數量較高(56～164條/50 mL土)，表明根結線蟲已完成至少1個侵染循環，并已孵化出大量的J2，同時，以處理1(CK)的J2數量最高，不同施藥或施肥處理的J2數量相對較低，該結果佐證了對第2次檢測結果的分析。第4次采樣的檢查結果顯示，各處理間的差異不顯著，依據單位體積根際土壤中J2數量，處理2和處理4明顯低于處理1(CK)，一定程度上反映出這2種農藥與肥料對J2產生的抑制效果。由于此次采樣距移栽時間約120 d，故侵染的線蟲至少已發生2個侵染循環，調查發現，紅河煙區在移栽后35 d，煙株根系已產生大量的卵塊團，完全可以孵化成J2，由于首個侵染循環至第2個侵染循環過程中所受影響因素較多，同時，施入的藥劑或肥料作用時間(或半衰期)存在差異，因而在第4次檢測中單位體積根際土壤J2數量出現較大起伏屬正常現象。

同一取樣時間不同處理數字后不同大小寫字母分別表示差異達0.01或0.05顯著水平，下同The capital and lower-case letter behind the number with different treatments indicated the significant difference at 0.01 and 0.05 level, respectively, the same as below圖1 4個時期煙株根際土壤單位體積(50 mL)中J2數量檢測Fig.1 Determination of nematode J2 amount in rhizosphere soil (50 mL) of tobacco plants during 4 growing stage

第2、3次采樣檢測根際土壤中J2數量，方差分析結果分別顯示極顯著差異和顯著差異。根據幾個處理在4個時期單位體積根際土壤中J2數量的變化，初步判斷生物農藥丁硫甲維鹽和肯邦線尊、以及油蘿卜秸稈發酵肥施用于煙株根際土壤中，對根結線蟲J2具有明顯的抑制效果。

2.2 采烤煙葉結束后挖根調查根結線蟲危害程度

試驗中的8個處理，處理1(CK)的病情指數最高，處理3病情指數最低，為24.00(相對防效為67.1 %)；其次處理8的病情指數為28.37(相對防效為61.1 %)；處理2的病情指數為36.20(相對防效為50.4 %)。其它處理對煙株根結線蟲病害均有不同程度的防控效果。進一步分析顯示，8個處理間的病情指數差異達極顯著水平，處理間F=4.64>F0.01=4.28，表明移栽煙苗前各處理與處理1(CK)具有極顯著的差異。處理1(CK)的平均病情指數為73，高于藥劑或生物質發酵肥處理后的病情指數。新復極差測驗顯示，只有處理7(中藥渣發酵肥)與處理1(CK)在同一水平上，該結果與單位體積根際土壤中J2數量的檢測結果相對應。

圖2 各處理病情指數Fig.2 Disease index investigation of root-knot nematode with different treatments

圖3 各處理采烤煙葉的產量Fig.3 Yield of cured tobacco leaves with different treatments

圖4 各處理采烤煙葉的產值測定Fig.4 Output value determination of cured tobacco leaves

2.3 采烤的煙葉分級、產量測定與產值測評

從圖3～4可見，平均產量以處理1(CK)最低，為2535.0 kg/hm2；最高產量是處理3，為3278.55 kg/hm2；其次是處理8，為3172.05 kg/hm2；處理7的產量最低，為2982.00 kg/hm2。該結果與病害調查結果相一致。8個處理重復小區折算的每公頃產量進行方差分析，處理間差異達極顯著水平，F=6.33>F0.01=4.28，表明不同生物農藥或生物質發酵肥對煙葉產量的影響存在極顯著的差異。通過新復極差測驗，施藥劑和施有機肥料的各處理在同一水平，但與處理1(CK)差異極顯著。有關產量方面新復極差測驗的結果與病情指數的測驗結果相一致。

從圖4可見，不同處理的產值排序與產量排序基本一致。方差分析的結果顯示，F=5.48>F0.01=4.28，各處理間產值的差異達到極顯著水平。移栽煙苗前的不同藥劑處理及空白處理間具有極顯著的差異。產值最高的處理3，為89 200.20元/hm2；其次是處理8，為88 612.50元/hm2；處理7產值為8296.05元/hm2。通過新復極差測驗，施藥劑和施肥的各處理在同一水平，但與處理1(CK)差異極顯著，與上述產量方面及根結線蟲病害方面的分析結果相一致。有關產值方面的方差分析結果與產量及病情指數的分析結果相印證。

2.4 煙田土壤主要養分檢測

土壤樣品在6月12-14日采集，當時已培土，有些處理已進行第3次施藥。煙株生長至團棵期。根據檢測結果，除了中藥渣發酵肥、萬壽菊秸稈發酵肥和厚孢輪枝菌各處理中土壤pH值低于處理1(CK)(表1)，及厚孢輪枝菌或苕子秸稈發酵肥各處理中速效鉀含量低于處理1(CK)，其它的數值均高于處理1(CK)，該結果表明在減施復混肥28.9 %的條件下，配施600 kg/hm2的生物質發酵肥，土壤主要養分高于常規只施750 kg/hm2復混肥的處理1(CK)。而且上述試驗處理的煙葉產量與產值也高于處理1(CK)。進一步對試驗小區6項指標的數據進行方差分析，各項指標的F測驗值均小于F0.05=2.76(表1)，表明這6項指標各處理間的差異不顯著，說明在配施生物質發酵肥與施藥條件下，減施復混肥28.9 %，可以滿足煙株生長需求。

表1 煙田土壤主要養分含量

從表1及其源數據還可以看出，多數試驗處理土壤的有機質、全氮、水解性氮、有效磷和速效鉀含量均比處理1(CK)高，只是因為田間土壤所受影響因素較多，檢測獲得的結果波動性大，方差分析結果顯示處理間差異不顯著。但配施所研發的發酵肥，可將復混肥減少至450 kg/hm2。

3 討 論

栽培作物的土壤中含有各類線蟲，包括腐生性線蟲和寄生性的病原線蟲。根結線蟲屬于內寄生的病原線蟲。栽培地的作物發生根結線蟲病害之后，病原根結線蟲的幼蟲和卵的數量會顯著增加[7-9]。研究中試驗地是上一年種植烤煙并發生較重的根結線蟲病害的煙田，移栽前土壤中存在一定數量的J2。而且，檢測到的J2有腐生性和寄生性的，包括病原根結線蟲的J2。曾探索到移栽煙苗后，室內和田間J2最早侵入根系的時間為6 d[18]，以此推測首批侵入根系的J2為土壤中已存在的，后續侵入根系的有可能是土壤中移栽煙苗后卵孵化的幼蟲。研究組已開展了大量的土壤樣品中J2數量檢測，檢測的樣品中有的數量極高，可能所采樣品來自發病較重的根系區域和采樣時間恰好是根系上卵塊大量孵化的時間，故出現個別樣品單位體積(50 mL)土壤中J2數量達到2000條以上的現象。從第4次采樣時期推測，病原根結線蟲有可能已發生2～4個侵染循環，故檢測結果存在波動性大，方差分析較難出現處理間差異顯著的現象。此外，不論藥劑或生物質發酵肥，對根結線蟲的作用均具有時效性。再者，土壤是微生物的大本營，會存在降解各類活性成分的微生物及其分泌的酶類。因而，后期的檢測結果中各處理間一般不會存在差異顯著的現象。

參試的丁硫甲維鹽和肯邦線尊農藥中均含有阿維菌素類成分。阿維菌素對病原線蟲具有毒殺作用[9-11]，迄今，阿維菌素類農藥可廣泛應用于防控根結線蟲病害，較安全的環境友好型生物農藥。其中還含有生物堿。近年來，范玉嬌等報道了關于生物堿殺線蟲活性的研究[12]。有關生物堿殺線蟲將是一個研究熱點。楊章明等報道了利用萬壽菊與厚孢輪枝菌防治煙草根結線蟲病害的效果[14]，顯示研究目標越來越多聚焦到根結線蟲病害的生物防控方面。

研究生物質發酵肥，選擇苕子秸稈發酵是因為其屬豆科植物，較早被用作綠肥作物[21]。選擇中藥渣作為生物質發酵原料，主要是近些年廢棄中藥渣已危害到生態環境[22-23]，中藥渣的主要原料是植物秸稈，加工成有機肥既解決了其危害性，又將廢棄物資源化利用，植物秸稈還田極大有利于生態環境。油蘿卜秸稈用于發酵肥原材料，主要原因是油蘿卜具有抗甜菜孢囊線蟲[24]和四種根結線蟲[25-26]，利用油蘿卜秸稈進行發酵，制備有機肥，除作有機肥料，還可防控根結線蟲病害。

4 結 論

種植煙草過程中，在育苗末期、移栽前和團棵期分別將阿維菌素類生物農藥與油蘿卜秸稈發酵肥配施，可減少復合肥28.9 %的施用量，并有效防控煙草根結線蟲病害，產量與產值顯著提高。

致 謝：徐宏韜和杜潮庚同學在實習期間參與了本研究的工作，特此感謝！