鴨茅幼苗對開花期白三葉不同部位化感作用的響應機理

張美艷，劉彥培，楊國盟，張 艷，黃梅芬，薛世明*

(1. 云南省草地動物科學研究院，云南 昆明 650212；2.云南省種畜繁育推廣中心,云南 昆明 650212)

【研究意義】化感作用(Allelopathy)是植物生態生理研究熱點之一，又稱為異株克生或他感作用，指的是一種植物通過向生長環境中釋放其產生的某些化學物質，進而對其周圍其他植物的生長發育產生有利或有害的影響[1-3]。化感作用在植物中廣泛存在[4-6]。【前人研究進展】白三葉對多年生黑麥草(Loliumperenne)、高羊茅(Festuca elata)、紫花苜蓿(Medicagosativa)、紅三葉(Trifoliumpratense)和蘿卜(Raphanussativus)等存在一定程度的化感效應[7-10]。鴨茅種子萌發及幼苗生長對紫花苜蓿(Medicagosativa)和紫莖澤蘭(Eupatoriumadenophorum)存在明顯的化感響應，且鴨茅對不同濃度水提液化感作用的感應強度不同[11-13]。【本研究切入點】白三葉+鴨茅混播草地在中國西南地區有著廣泛應用[14-15]，而放牧是白三葉+鴨茅混播草地最主要的利用方式[16-17]。而關于化感作用在白三葉+鴨茅混播草地建植和利用中的研究報道較少。【擬解決的關鍵問題】文章主要探討白三葉開花期不同部位浸提液對鴨茅幼苗生長發育的影響，旨在為鴨茅和白三葉混播草地的建植和高效管理提供指導依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗所用提取液的供體牧草白三葉來自云南昆明北郊試驗基地(N 25°11′，E102°59′，海拔1995 m)。受體植物是鴨茅(品種為安巴)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集與處理 挖取開花期白三葉植株，先用自來水沖洗，再用無菌雙蒸水沖洗2～3次，直至沖洗干凈。再用無菌濾紙吸干植株表面的水分，分離莖、葉、根，再分別剪成1～2 cm小段樣品備用。

1.2.2 白三葉浸提液的制備 母液的制備：將處理好的白三葉根、莖、葉樣品分別進行稱重，置于500 mL錐形瓶，按樣品l g加無菌雙蒸水4 mL進行配制，封口后置于搖床25 ℃下浸泡震蕩48 h，之后進行二重過濾，濾液即是浸提液母液，濃度為0.25 g/mL，保存在4 ℃冰箱備用。

處理溶液的制備：按照稀釋比例，用無菌雙蒸水將母液稀釋成不同濃度(0.005、0.01、0.05、0.10和0.15 g/mL)的處理溶液，如不立即施用，處理液也需在4 ℃下保存。對照處理為無菌蒸餾水。

1.2.3 試驗處理 利用人工氣候培養箱(一恒MGC-350)進行幼苗培育。用發芽盤進行鴨茅種子萌發，20 ℃黑暗3 d，第4天開始每天光照25 ℃10 h，黑暗20 ℃14 h，培養12 d(鴨茅幼苗長度4～5 cm)時，挑選生長一致幼苗，移栽至發芽盒(19 cm×13.5 cm×8 cm)上，每個發芽盒裝有全濃度霍格蘭德(Hoagland)營養液800 mL，營養液每3 d更換1次。培養12 d后，用預選配好的莖、葉、根浸提液替換營養液，進行浸提液處理。處理期間，每天25 ℃10 h光照，20 ℃14 h，無菌雙蒸水為對照處理。處理10 d采集樣品進行指標測定。

1.3 指標測定

測定指標是鴨茅幼苗電解質滲透率、丙二醛、 超氧化物歧化酶活性、過氧化氫酶活性等，測定方法參照植物生理學實驗指導測定方法[18]。

1.4 數據處理

采用SPSS 19.0進行數據方差分析，用Duncan法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 鴨茅幼苗葉片和根系電解質滲透率對開花期白三葉不同部位浸提液的響應

鴨茅幼苗葉片電解質滲透率對開花期白三葉莖、葉、根浸提液的響應不同。無論是白三葉的莖還是根浸提液，隨著處理濃度增加鴨茅幼苗葉片電解質滲透率均呈逐步上升的趨勢。根浸提液在濃度0.10 g/mL時，鴨茅幼苗葉片電解質滲透率達到最大，比對照增加122.0 %；且濃度0.10～0.15 g/mL的處理極顯著高于對照(P<0.01)。莖浸提液在最大濃度0.15 g/mL時鴨茅葉片電解質滲透率達到最大，比對照增加175.0 %；0.05～0.15 g/mL濃度處理極顯著高于對照(P<0.01)。然而，與白三葉根、莖浸提液不同，葉浸提液處理下鴨茅幼苗葉片電解質滲透率無明顯上升趨勢(P>0.05)。由此得出鴨茅葉片電解質滲透率對開花期白三葉莖、根浸提液的響應要比葉浸提液更加敏感(表1)。

鴨茅幼苗根系電解質滲透率對開花期白三葉莖、葉、根浸提液的響應明顯不同(P<0.05)。不同部位浸提液處理下，隨著濃度增加鴨茅幼苗根系電解質滲透率整體上表現出上升趨勢，均在最大濃度0.15 g/mL處理時，鴨茅幼苗根系電解質滲透率達到最大值，分別比對照增加189.0 %、201.0 %和63.0 %。根浸提液處理下，0.05～0.15 g/mL濃度處理極顯著高于對照(P<0.01)。莖浸提液處理下，所有濃度處理均極顯著高于對照(P<0.01)。葉浸提液處理下，0.005 g/mL和0.10～0.15 g/mL處理極顯著高于對照(P<0.01)。相比葉浸提液，鴨茅幼苗根電解質滲透率對白三葉根、莖浸提液的響應要更加敏感，尤其是莖浸提液(表2)。

2.2 鴨茅幼苗丙二醛含量對開花期白三葉不同部位浸提液的響應

鴨茅葉片丙二醛含量對開花期白三葉不同部位浸提液的響應不一致。其中，白三葉根和莖浸提液處理下，隨著處理濃度的增加鴨茅葉片丙二醛含量均呈現出明顯升高的趨勢(P<0.01)，均在濃度0.15 g/mL處理時，鴨茅葉片丙二醛含量最高，分別是23.20和33.69 nmol/g。但是，鴨茅葉片丙二醛含量對開花期白三葉葉浸提液的響應不同于根和莖浸提液，在0.005 g/mL濃度處理時，鴨茅葉片丙二醛的含量最大，隨著處理濃度不斷增高呈現出先降低后升高趨勢(P<0.05，表1)。表明，開花期白三葉葉浸提液對鴨茅生長的抑制作用明顯高于根和莖。

表1 鴨茅幼苗葉片電解質滲透率、丙二醛和脯氨酸含量對開花期白三葉不同部位浸提液的響應

鴨茅根系丙二醛含量對開花期白三葉不同部位浸提液處理的表現較為一致，均表現出隨著處理濃度的增加呈現出先升高后降低的趨勢。且鴨茅根系丙二醛含量對開花期白三葉莖及葉浸提液的響應較根浸提液更為敏感。白三葉莖浸提液0.05 g/mL時，鴨茅根系丙二醛含量就達到最高(P<0.05)，0.01～0.15 g/mL處理與對照差異極顯著(P<0.01)。白三葉葉浸提液0.10 g/mL時，鴨茅根系丙二醛含量達到最高值，比對照增加54.2 %(P<0.01)，而其余處理下的鴨茅根系丙二醛含量與對照差異不顯著(P>0.05)；而白三葉根浸提液不同濃度處理下的鴨茅根系丙二醛含量差異不顯著(P>0.05，表2)。表明白三葉莖、葉浸提液化感潛力要高于根浸提液。

2.3 鴨茅幼苗脯氨酸含量對開花期白三葉不同部位浸提液的響應

鴨茅葉片脯氨酸含量對開花期白三葉不同部位浸提液的響應存在顯著差異(P<0.05，表1)。其中，白三葉根及葉浸提液，隨著濃度的增加鴨茅幼苗受到抑制作用，脯氨酸含量呈增加趨勢，均在0.15 g/mL處理濃度下達到最大，高濃度(0.10～0.15 g/mL)處理顯著高于對照(P<0.05)。而白三葉莖浸提液在濃度0.10 g/mL時脯氨酸含量達到最大(P<0.01)。可以看出，鴨茅幼苗葉片中脯氨酸含量均是在低濃度0.005～0.05 g/mL未受到顯著影響或受抑反應較低，在高濃度0.10～0.15 g/mL處理下表現出明顯的受抑反應，且鴨茅幼苗葉片脯氨酸對莖浸提液的響應要比葉和根浸提液更加敏感。

鴨茅根系脯氨酸含量對開花期白三葉不同部位浸提液的響應不一致(表2)。隨著葉浸提液濃度增加，鴨茅幼苗根系脯氨酸含量呈現出不斷升高趨勢，在濃度0.05～0.15 g/mL處理下極顯著高于對照(P<0.01)。但是，鴨茅幼苗根系脯氨酸含量對開花期白三葉根及莖浸提液的響應均是先升高后下降趨勢。在根浸提液處理下，濃度0.05 g/mL處理時鴨茅根系脯氨酸含量達到最大，顯著高于對照(P<0.01)，其余處理間均無明顯差異(P>0.05)。在莖浸提液處理下，濃度0.005～ 0.05 g/mL處理下鴨茅根系脯氨酸含量極顯著高于對照，在低濃度0.005 g/mL處理時，鴨茅就表現出明顯受抑效應(P<0.05)；而白三葉葉及根浸提液均是在0.05 g/mL處理時鴨茅才表現出明顯受抑效應(P<0.05)，這表明鴨茅根系脯氨酸對白三葉莖浸提液的受抑響應要早于根及葉浸提液，這與鴨茅葉片脯氨酸的響應較為一致。

表2 鴨茅幼苗根系電解質滲透率、丙二醛和脯氨酸含量對開花期白三葉不同部位浸提液的響應

不同小寫字母和大寫字母分別表示同一部位不同濃度處理間5 %和1 %水平差異顯著，下同Different lower case letters and upper case letters indicated significant difference between different concentration of aqueous extract from the same part of Trifolium repens at 5 % and 1 %, respectively，the same as below圖1 鴨茅幼苗超氧化物歧化酶(SOD)活性對白三葉根浸提液的響應Fig.1 Effect of Trifolium repens root aqueous extract on the SOD activities of Dactylis glomerata seedling

2.4 鴨茅幼苗抗氧化酶活性對開花期白三葉不同部位浸提液的響應

2.4.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性 白三葉根和莖浸提液處理下，鴨茅幼苗葉片中SOD活性均呈現出先上升后下降趨勢。其中，根浸提液在濃度0.05 g/mL處理下鴨茅葉片SOD活性達到最大，顯著高于0.005和0.01 g/mL濃度處理(P<0.05)，但與對照差異不顯著(P>0.05，圖1)。莖浸提液處理下，0.10 g/mL濃度處理下的鴨茅葉片SOD活性達到最大，極顯著高于對照和其他處理(P<0.01)，低濃度0.005～0.01 g/mL處理下的SOD活性極其顯著低于對照(P<0.01，圖2)。然而，葉浸提液處理各濃度處理間差異不顯著(P>0.05，圖3)。以上表明，鴨茅幼苗葉片SOD活性對開花期白三葉不同部位浸提液的響應不一致，其中根和莖浸提液呈現出“凸”規律，在中間濃度處理下的SOD活性達到最大；而葉浸提液均為抑制作用；鴨茅幼苗葉片SOD活性對白三葉莖和根浸提液的響應要明顯高于葉浸提液。

隨著白三葉根、莖、葉浸提液濃度的增加，鴨茅幼苗根系SOD活性均表現出先上升后下降趨勢，且均在濃度0.10 g/mL處理下SOD活性達到最大，極顯著高于對照和其他處理(P<0.01)，分別比對照增加214 %、465 %和180 %。由此可見，鴨茅根系SOD活性對開花期白三葉莖浸提液的響應要比根和葉浸提液更加明顯(圖1～3)。白三葉根和莖浸提液處理下，均是低濃度0.005 g/mL處理與對照差異不顯著(P>0.05)，高濃度(0.05～0.15 g/mL)與對照差異極顯著(P<0.01)。而葉浸提液，低濃度0.005 g/mL處理顯著低于對照(P<0.05)，高濃度(0.05～0.15 g/mL)處理均顯著高于對照(P<0.05，圖3)。由此得出鴨茅幼苗SOD活性對開花期白三葉莖浸提液的響應要比根和葉浸提液更加明顯。

圖2 鴨茅幼苗超氧化物歧化酶(SOD)活性對白三葉莖浸提液的響應Fig.2 Effect of Trifolium repens stem aqueous extract on the SOD activities of Dactylis glomerata seedling

圖3 鴨茅幼苗超氧化物歧化酶(SOD)活性對白三葉葉浸提液的響應Fig.3 Effect of Trifolium repens leaf aqueous extract on the SOD activities of Dactylis glomerata seedling

2.4.2 過氧化物酶(POD)活性 白三葉根浸提液處理下，鴨茅幼苗葉片中的POD活性整體呈現出明顯下降趨勢(P<0.05)。其中，根浸提液處理下，鴨茅葉片POD活性均極顯著低于對照(P<0.01，圖4)；莖浸提液處理下，不同濃度處理均與對照差異極顯著(P<0.01)，濃度0.005 g/mL處理下的鴨茅葉片POD活性極顯著高于對照(P<0.01，圖5)；葉浸提液處理下，低濃度0.005、0.01 g/mL處理下的鴨茅葉片POD活性均顯著大于對照(P<0.05)，其余濃度處理均極顯著低于對照(P<0.01，圖6)。說明鴨茅葉片POD活性對白三葉莖、葉浸提液的響應要比根浸提液更加敏感。

字母下劃線是表示CAT酶活性的差異性，下同Letters underline indicated the significance among CAT enzyme activity, the same as below圖4 鴨茅幼苗過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性對白三葉根浸提液的響應Fig.4 Effect of Trifolium repens root aqueous extract on the POD and CAT activities of Dactylis glomerata seedling

圖5 鴨茅幼苗過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性對白三葉莖浸提液的響應Fig.5 Effect of Trifolium repens stem aqueous extract on the POD and CAT activities of Dactylis glomerata seedling

白三葉不同部位浸提液處理下，鴨茅根系POD活性的響應不一致。其中，根浸提液和莖浸提液處理下，鴨茅根系POD活性呈整體上升趨勢，均在高濃度0.15 g/mL處理下達到最大值，極顯著高于對照和其他處理(P<0.01)，分別是對照處理的70.65倍和31.84倍；莖浸提液處理下的鴨茅幼苗根系POD活性均極顯著高于對照處理(P<0.01，圖4～5)。葉浸提液處理下，隨著濃度增加鴨茅根系POD活性呈現先升高后降低趨勢， 0.01～0.15 g/mL濃度處理下鴨茅根系POD活性極顯著高于對照(P<0.01，圖6)。表明，鴨茅根系POD活性對白三葉根和莖浸提液的響應要比葉浸提液更加敏感。

2.4.3 過氧化氫酶(CAT)活性 鴨茅葉片和根系CAT活性對白三葉不同部位浸提液的響應不一致，且鴨茅葉片CAT活性對白三葉不同部位水浸體液的響應變化幅度整體要大于根系CAT活性的變化幅度。鴨茅葉片CAT活性對白三葉根浸體液和浸體液的響應較為一致，隨著處理濃度的增加表現出先上升后下降的趨勢，均在0.01 g/mL處理下達到最大，顯著高于高濃度(0.05，010和0.15 g/mL)處理(P<0.05)，且與低濃度0.005 g/mL和對照處理差異不顯著(P>0.05，圖4～5)。然而，鴨茅葉片對白三葉葉浸提液的響應不同于根和莖浸提液，隨著處理濃度增加，鴨茅葉片CAT活性呈顯著下降趨勢，不同濃度處理下的鴨茅葉片CAT活性均極顯著低于對照處理(P<0.01，圖6)。

圖6 鴨茅幼苗過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性對白三葉葉浸提液的響應Fig.6 Effect of Trifolium repens leaf aqueous extract on the POD and CAT activities of Dactylis glomerata seedling

鴨茅根系CAT活性對白三葉不同部位浸提液的響應也不相同。其對白三葉根浸提液和莖浸提液的響應較為一致，均隨著處理濃度的增加呈現出升高的趨勢；在0.15 g/mL處理下的鴨茅根系CAT活性，極顯著高于對照處理(P<0.01)；且對莖浸提液的響應更為敏感(圖4～5)。鴨茅根系對白三葉葉浸提液的響應不同于白三葉的根和莖，隨著浸提液濃度的增加，鴨茅葉片CAT活性呈降低的趨勢(圖6)。

3 討 論

丙二醛(MDA)是反映膜脂過氧化和組織的抗氧化能力強弱程度的指標之一[19]，同時，也是一種有害物質，能與細胞內各種成分發生反應，導致膜結構及生理完整性的破壞[20]。本研究中，隨著白三葉各部位浸提液濃度的增加，鴨茅幼苗葉片MDA含量呈上升趨勢，這可能是鴨茅幼苗葉片膜質過氧化程度增強，引起了細胞酶和膜的嚴重損傷，進而導致MDA含量增加，也可能是由于活性氧清除劑活性受到抑制而造成的[21]。這與紫莖澤蘭(Eupatoriumadenophorum)葉水提液對玉米(Zeamays)、黃花蒿(Artemisiaannua)浸提液對小白菜(Brassicachinensis)和蘿卜幼苗生長的化感效應的研究結果相似[19, 22]。而鴨茅幼苗根系MDA含量隨著白三葉不同部位浸提液濃度的增加，呈現出先上升后下降的趨勢，且在達到最大之后又出現降低現象，可能是由于鴨茅根系一些化感物質被釋放，或是感應到環境脅迫時產生的一種對環境脅迫的適應機制[9]。

白三葉植株會釋放酚類化感物質[23]，酚類物質會影響受體植物細胞的生長分化和抗氧化物酶(SOD)活性，破壞受體植物細胞內自由基平衡和細胞膜的正常運作，影響植物的生長發育[24-25]。SOD可以清除植物體內的氧自由基，調節膜脂過氧化水平，保護細胞膜受傷，在白菜(Brassicapekinensis)等植物上的研究指出，隨著白三葉莖葉浸提液濃度的增加，白菜、紫花地丁(ViolayedoensisMakino.)和蘿卜幼苗SOD活性呈下降趨勢[25]，這與本研究的結果不同。植物SOD活性下降表明SOD酶逐漸失去活性，進而導致受體植物鴨茅生長受到的抑制逐漸增強，這可能植物抗氧化酶適應逆境脅迫的一種機制[26]。表明，植物化感作用是植物進化過程中應對周圍環境脅迫形成的一種適應機制[27]。

4 結 論

通過用開花期白三葉不同部位浸提液處理鴨茅幼苗，測定鴨茅地上部和地下部電解質滲透率和SOD活性等指標的測定得出，鴨茅幼苗葉片和根系對開花期白三葉不同部位浸提液，以及同一部位不同濃度的化感作用響應不同。鴨茅葉片和根系電解質滲透率對開花期白三葉莖、根浸提液的響應要比葉浸提液更加敏感。鴨茅幼苗葉片和根系丙二醛含量對白三葉不同部位浸提液的響應是莖和葉>根。從鴨茅幼苗脯氨酸含量變化可得出，白三葉不同部位浸提液表現出“低濃度無抑制，高濃度抑制”的影響，且莖>根≈葉。綜合鴨茅葉片和根系SOD、POD和CAT活性變化，均表現出莖>根≈葉。綜合各項指標，得出開花期白三葉莖浸提液對鴨茅幼苗的化感作用較大，其次是根和葉。因此，在人工混播草地建植和管理環節，需嚴格控制混播用種白三葉的播種比例和監控其繁殖比例，將白三葉對混播草地的化感影響降到最低。