洱海流域油菜-水稻輪作農田土壤細菌多樣性特征

伏成秀，李銘剛，吳 翔，付 斌，張 慶，施竹鳳，倪 明，胡萬里，楊明英，朱紅業，楊佩文*

(1. 云南省農業科學院農業環境資源研究所，云南 昆明 650205；2. 云南大學，云南 昆明 650091；3. 四川省農業科學院土壤肥料研究所，四川 成都 610066)

【研究意義】洱海北部地區農田每年因淋溶而流入湖泊的氮磷是導致水體富營養化的主要污染源[1]。尋求控源減排兼顧產量、經濟效益和環境效益的適宜水肥管理模式是提高土壤生產力，防治土壤氮磷素流失和保護水質的重要研究內容[2]。【前人研究進展】相關研究指出，通過合理施肥，平衡農田土壤養分，使輸入與輸出趨于平衡，減少養分累積與流失，是綜合治理農業面源污染的主要技術措施[3]。國內外很多室內模擬試驗、田間長期定位試驗和區域調查監測等碳氮耦合關系研究結果表明，合理施肥能夠保持或提高土壤碳氮含量，有機碳在一定程度上有利于氮積累，而氮輸入可減少有機碳礦化而促進碳累積，二者間存在耦合關系[4]。雷寶坤等研究結果表明，土壤“碳匯”可以增強“氮匯”的功能，從而阻止土壤氮素的流失，實現碳素控制農田氮素流失的面源污染[5]。張丹等在洱海流域水稻-油菜輪作農田設置長期定位試驗，基于秸稈還田對土壤微生物熵和微生物量碳/氮變化動態的影響，初步探討了有機碳源物料輸入降低土壤氮素流失的影響機制，結果表明，有機碳源物料輸入增強了土壤微生物氮素固持能力而有效降低了土壤氮素流失的風險，但系統深入的微生物過程有待進一步研究[6]。【本研究切入點】洱海流域地區是多元少數民族文化匯集地區，特殊的地形-氣候-水文特征及人類活動等的耦合，形成了該區域土壤富含有機質，碳氮庫明顯高于其它地域土壤的特點，但目前對其碳氮共濟效應關鍵的土壤微生物過程缺乏深入系統的研究，制約了對區域農田優化管理的準確性和全面性[7]。【擬解決的關鍵問題】本研究基于油菜-水稻輪作種植模式下有機碳源輸入定位試驗，運用微生物核糖體RNA基因靶向測序技術和qPCR技術，分析土壤細菌種群結構組成、豐度以及碳氮轉化功能基因豐度的差異，解析其變化特征；結合Perason相關性分析，解析細菌多樣性和種群結構對有機碳源物料輸入的響應特征。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況和試驗設計

持續開展陳安強等的定位試驗[8]，試驗田位于洱海流域洱源縣鳳羽鎮(99°57′E，25°58′N)，海拔2099 m，年平均氣溫13.90 ℃，年降水量745.00 mm，土壤類型為水稻土，典型的北亞熱帶高原季風氣候，水稻-油菜水旱輪作種植模式，油菜種植時間為當年的11月，收獲時間為次年5月，水稻種植時間為當年6月，收獲時間為10月。本研究選取其中5個處理為研究對象，即處理1(CK)，不施用有機肥和氮磷鉀化肥；處理2，不施用有機肥，單施用氮磷鉀化肥；處理3，玉米秸稈+化肥；處理4，蠶豆秸稈+化肥；處理5，松針+化肥。各處理的重復設置、面積、施肥(品種、用量、時期等)和有機碳源物料(品種、用量、時期等)等試驗內容與陳安強等的設置相同[8]。

1.2 土壤樣品采集、處理

2019年于油菜和水稻收獲期按照常規取樣法分別取0～20 cm土層土樣，每個小區對角線5點取樣，然后混合均勻為1個樣，挑除根系等雜質后，一部分土樣過1 mm 篩后迅速放入做好標記的自封袋中，置于低溫保溫箱中，帶回實驗室后分成2份，一份于-80 ℃冰柜中預冷凍1 h后再進行冷凍干燥，待充分干燥后置于-80 ℃冰柜妥善保藏，以備后續DNA提取用。另一份進行自然風干，待充分干燥后置于室溫妥善保藏，用于后續理化性質分析。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤養分指標測定 土壤全氮(TN)含量采用凱氏定氮法測定，有機質(OM)含量采用重鉻酸鉀外加熱法測定，土壤pH采用pH 儀進行測定[9]。

1.3.2 土壤DNA 提取、細菌16S rRNA基因的高通量測序 土壤微生物總DNA用OMEGA 土壤總DNA提取試劑盒按操作說明書進行提取，DNA提取質量通過0.8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA定量采用紫外分光光度計定量。合格DNA 送至上海派森諾生物股份有限公司進行高通過測序。分別對細菌16S rRNA的單V區(V4)和真菌ITS1區進行PCR擴增，細菌16Sr RNA V4區PCR擴增引物為520F(5′AYTGGGYDTAAAGN3′)和802R(5′TACNVGGGTATCTAATCC3′)。以擴增產物為模板進行Illumina MiSeq測序文庫制備，并進行Illumina MiSeq系統測序。

1.3.3 土壤微生物高通量測序數據統計分析 測序原始數據經疑問序列識別、檢查并剔除嵌合體序列，獲得樣本的有效序列[10]。以每個OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列，基于97 %的序列相似度進行OTU歸并和劃分，構建各樣本中OTU豐度矩陣。根據OTU豐度矩陣結果，計算每個樣本中共有的OTU數量；以Chao1豐富度指數和ACE指數評價微生物群落豐富度；以Shannon多樣性指數和Simpson多樣性指數評價微生物群落的均勻度。利用每個OTU的代表序列，進行對應數據庫的模板序列比對，細菌16S rRNA基因模板序列基因庫選用Greengenes數據庫(Release 13.8，http://greengenes. secondgenome.com/)[11]。通過OTU分類地位鑒定，獲得每個OTU所對應的分類學信息，統計每個樣本在各分類水平組成。

1.3.4 土壤碳氮轉化功能微生物qPCR定量檢測分析 土壤DNA 提取方法、質量和濃度及純度檢測同上。選取碳固定cbbL-R基因、氮固定的nifH基因和硝化作用的amoA、amoB基因為標記基因，各功能基因擴增所用引物序列及定量PCR擴增程序參照顧卿等[12]。以土壤DNA為模板，進行各個功能基因的PCR擴增，隨后進行目的片段回收純化、質粒轉化(pMD18-T-158)、計算質粒濃度和拷貝數，建立標準曲線。通過PCR擴增獲得檢測樣品的Ct 值，并計算特異性基因片段拷貝數。具體操作方法參照Walker等反應體系及方法[13]。

1.4 數據統計分析

測試數據經Microsoft Excel軟件整理；用DPS 7.05 Duncan多重比較法檢驗處理間差異性；用SPSS 18.0 的Perason雙變量相關分析法分析不同因子間相關性。

2 結果與分析

2.1 土壤碳、氮素含量及pH

如圖1所示，化肥處理的土壤有機質、碳氮比和pH等3個理化指標均低于處理1(CK)，全氮含量則高于處理1(CK)，差異性顯著(P<0.05)；而有機碳源物料配施化肥各處理的土壤有機質含量、全氮含量和碳氮比等3個指標數值則均有顯著提升，差異性顯著(P<0.05)。與油菜種植季相比，水稻種植季后土壤的有機質含量、全氮含量和碳氮比等3個指標數值均呈降低趨勢。

圖2 土壤樣本細菌Clean tags、OTUs豐度及α多樣性指數Fig.2 Soil clean tags, OTUs abundance and diversity index of each soil samples

2.2 土壤細菌種群多樣性

如圖2所示，各處理的細菌Clean tags和OTUs差異性不顯著(P≥5)；豐富度指數Chao1和ACE以及均勻度指數Shannon和Simpson等4個多樣性指數差異性均不顯著(P≥5)；在不同的種植季，土壤細菌Clean tags數、OTUs豐度及α多樣性指數等的差異性均不顯著(P≥5)。

2.3 土壤細菌種群組成

如表1所示，根據物種注釋結果，在細菌門的分類水平上檢測到的前5個優勢細菌種群，其相對豐度從大到小依次為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)，5個優勢細菌種群占總原核微生物群落豐度的91 %以上。在不同的種植季，細菌門分類上的種群結構組成相似，平均相對豐度所占比例略有差異，但差異性未達顯著水平(P≥5)，兩季呈相似變化趨勢。

2.4 土壤環境因子與細菌種群間的相關分析

如表2所示，細菌種群中的Proteobacteria和Acidobacteria種群相對豐度與土壤有機質含量和全氮含量呈顯著負相關關系(P<0.05)，Chloroflexi和Actinobacteria種群相對豐度與土壤有機質含量和全氮含量間則呈顯著正相關關系(P<0.05)。不同種植季土壤碳氮素與細菌種群相對豐度的關系呈相似趨勢。

2.5 土壤碳氮功能基因qPCR定量檢測統計結果

以單位土壤質量DNA提取基因的拷貝數表征基因豐度，如表3所示，cbbL-R基因拷貝數各處理間差異性不顯著(P≥5)。處理1(CK)與處理2間nifH拷貝數差異性不顯著(P≥5)，而有機碳源物料配施化肥各處理的基因拷貝數則顯著增加(P<0.05)。單施化肥處理和有機碳源物料配施化肥處理均能顯著提高amoB的拷貝數；所有處理間amoA拷貝數差異性則不顯著(P≥5)。碳氮轉化功能基因拷貝數呈amoB>nifH>amoA>cbbL-R的趨勢，相對于nifH拷貝數和amoA拷貝數，cbbL-R拷貝數少一個數量級；相對于nifH拷貝數和amoA拷貝數，amoB的拷貝數則高一個數量級。水稻種植季后各處理nifH拷貝數明顯增加，其它基因拷貝數與油菜種植季呈相似變化趨勢。

表4 土壤碳氮功能微生物種群與土壤環境因子相關性的Pearson分析

如表4所示，Perason分析結果表明，nifH拷貝數與土壤有機質含量和全氮含量間呈極顯著正相關關系(P<0.01)；其它功能基因拷貝數與土壤環境因子間呈正相關關系或負相關關系，但差異未達顯著性水平(P≥5)。油菜-水稻種植季土壤碳氮素對碳氮轉化功能基因拷貝數的影響呈相似趨勢。

3 討 論

3.1 油菜-水稻輪作模式下土壤細菌種群變化特征

從試驗區土壤碳、氮素變化情況來看，在油菜-水稻輪作種植式下，單施化肥降低土壤有機質和碳/氮比，而有機碳源物料配施化肥均提高土壤有機質和碳/氮比，與油菜種植季相比，水稻種植季后土壤有機質、全氮和碳/氮比均呈下降趨勢，這可能是水稻種植季部分碳氮素溶于水而淋失有關。但從總體趨勢來看，土壤碳/氮比與有機質和全氮間呈顯著正相關關系，說明可以通過增加土壤有機質含量提高土壤氮固存，從而減少氮流失的策略的可行性。從土壤細菌種群結構組成變化特征分析結果看，油菜-水稻水旱輪作模式和不同施肥處理未對其產生顯著影響，可能與其土壤較高的碳氮素含量有關。相關研究也表明，土壤中碳氮素的有效性是決定土壤微生物多樣性和功能多樣性的重要因素，微生物群落能夠通過調節自身的養分利用效率而適應資源的不平衡[14-15]。仇存璞等在研究2種典型水稻土秸稈碳轉化的微生物過程發現，稻田土壤有機質的含量和成份組成是影響微生物生物量和群落組成的核心因素，外源有機碳源物料添加主要導致了有機質降解功能微生物種群結構的變化，但土壤原有的有機質含量和成份組成是導致這種變化的重要因素[16]。

3.2 油菜-水稻輪作模式下土壤碳氮轉化功能基因豐度變化特征

微生物是土壤碳氮素轉化關鍵過程的驅動者與調節者，微生物通過酶的催化作用介導代謝過程，而酶活性受相應功能基因調控。其中，碳固定cbbL-R基因，甲烷代謝mcrA基因，纖維素降解CBH基因，氮固定的nifH基因，硝化作用的amoA基因，反硝化作用的nirK和nirS基因等均廣泛應用于環境微生物生態學研究，基因拷貝數可以指示碳氮轉化功能微生物的豐度[17]。本研究結果表明，各處理間固碳基因cbbL-R豐度差異性不顯著，化肥施用或有機碳源物料配施化肥對基因豐度的影響均不顯著，可能與試驗區土壤本底較高碳氮素含量有關。單施化肥處理顯著提高amoB基因豐度，而對amoA基因豐度影響不顯著，表明在該試驗區域土壤TN含量對amoB基因豐度的影響大于amoA基因豐度。相關研究也表明[18]，參與氮硝化作用的氨氧化細菌(AOB)和氨氧化古菌(AOB)具有完全不同的生態位，土壤氮素含量是決定其豐度的重要因素，高氮土壤環境是AOB驅動氮硝化作用的功能微生物，而低氮土壤環境是AOA驅動氮硝化作用的功能微生物，土壤環境條件主導AOB和AOA的生理生態功能，進而對硝化作用過程產生影響。有機物料配施化肥顯著提高nifH基因和amoB基因豐度，表明化肥施用以及有機物料通過礦化和降解釋放氮補充土壤氮庫，促進了固氮細菌的生長繁殖，顯著提高固氮微生物種群的豐度；同時避免了固氮微生物與作物競爭氮素，促進作物生長，提高土壤自身固氮能力，與劉驍蒨等的試驗結果相同[19]。從不同種植季碳氮功能基因豐度變化來看，水旱輪作種植模式對固碳基因cbbL-R和硝化作用amoA、amoB基因的豐度影響不顯著，但水稻種植季顯著提高了氮固定的nifH基因的豐度，水稻種植促進了固氮微生物種群豐度和活性，對固碳功能微生物種群和氮硝化功能微生物種群豐度和活性的影響較小。研究結果中碳氮轉化功能基因豐度的變化情況直接反映了較高碳氮素含量土壤背景下，碳氮轉化功能微生物種群豐度對油菜和水稻輪作種植模式對的響應情況。

4 結 論

在洱海流域油菜-水稻水旱輪作農田，土壤有機質(OM)和全氮(TN)與細菌種群中的變形菌門(Proteobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)的種群相對豐度呈顯著負相關關系，與綠彎菌門(Chloroflexi)和放線菌門(Actinobacteria)的種群相對豐度呈顯著正相關關系；其中，土壤OM對微生物種群豐度的影響解釋度最高。在油菜和水稻種植季，不同處理間Clean tags數量、OTUs豐度及α多樣性指數差異性不顯著(P≥5)，門分類水平上的優勢細菌種群相對豐度差異性不顯著(P≥5)。

處理間固碳基因cbbL-R和氨氧化基因amoA的拷貝數差異性不顯著(P≥5)，有機碳源物料配施化肥顯著提高固氮基因nifH和氨氧化基因amoA拷貝數(P<0.05)；土壤全氮(TN)對土壤碳氮轉化功能基因拷貝數影響的解釋度最高。在油菜和水稻種植季，油菜和水稻種植季土壤碳氮轉化功能基因豐度呈相似變化趨勢。

在洱海流域油菜-水稻水旱輪作農田，水旱輪作對土壤細菌種群多樣性的影響不顯著(P≥5)，其群落結構組成和多樣性穩定性可能與土壤本底較高的碳氮素含量有關。