基于離子交換色譜法檢測結核治療性DNA疫苗純度的方法建立

孔雯雯，周飛燕，符美娟，楊麗菲，梁艷，吳雪瓊，倪世明，黃明

(1.廣州白云山拜迪生物醫(yī)藥有限公司，廣東 廣州 511495；2.中國人民解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學中心結核病重點實驗室，北京 100091)

結核病是由結核分枝桿菌引起的呼吸道傳染病，屬于重大傳染病之一[1-2]。臨床上應用最為廣泛的結核疫苗為卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)，其對新生兒及兒童結核性腦膜炎和粟粒性肺結核具有有效預防效果，但對成人結核病和結核分枝桿菌潛伏感染保護效果有限[3-9]。目前已有多種結核候選疫苗處于臨床研究階段，主要包括用于增強BCG免疫效力的蛋白亞單位疫苗、病毒載體疫苗和治療性DNA疫苗，及代替BCG的重組BCG等[10-18]。結核治療性DNA疫苗是采用基因重組技術構建，通過細菌發(fā)酵、裂解和純化后制備的質粒DNA，為確保質粒的質量，質粒DNA疫苗的指導原則要求對DNA的純度進行質量控制[19]。目前對DNA純度的檢測方法主要有瓊脂糖凝膠電泳和高效液相色譜法[20-22]。瓊脂糖凝膠電泳法操作簡便但分辨率較低，高效液相色譜法可以更準確地檢測DNA純度。為了對生產(chǎn)制備的結核治療性DNA疫苗進行有效質量控制，本文擬采用高效液相色譜法檢測重組質粒DNA制劑的純度。該法是通過陰離子交換色譜法對質粒DNA進行分離并在特定波長進行測定，采用面積歸一化法計算目的質粒峰的百分比，從而建立結核治療性DNA疫苗的純度的檢驗方法，并對該方法進行驗證，為結核治療性DNA疫苗質量控制和質量標準的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 三羥甲基氨基甲烷(Tris Base，色譜純)購自美國Merck公司；氯化鈉(分析純)和鹽酸(分析純)均購自廣州化學試劑廠；氯化鈉(藥用級)購自河北華晨藥業(yè)有限公司；磷酸氫二鈉(藥用級)、磷酸二氫鈉(藥用級)購自湖南九典制藥有限公司；結核DNA疫苗成品(20170301、20170302、20170303)為廣州白云山拜迪生物醫(yī)藥有限公司制備的樣品；Agilent 1100 高效液相色譜儀(配有 G1315B DAD 檢測器、 G1311A 四元梯度泵、G1322A在線脫氣裝置、G1316A柱溫箱)和化學工作站(ChemStation，版本號：Rev.A.10.01[1635])均購自美國安捷倫科技有限公司；Agilent 1260 高效液相色譜儀(配有G7117C DAD 檢測器、 G7111A 四元梯度泵、G7129A 自動進樣器、G7116A 柱溫箱)和化學工作站(Openlab 2.1chemstation)均購自美國安捷倫科技有限公司；BS124S 型電子天平購自德國賽多利斯科學儀器有限公司；色譜柱 TSK-gel DNA-NPR(4.6 mm×75 mm,2.5 μm)購自日本Tosoh公司。

1.2 供試品溶液及PBS對照液的配制 用流動相A將20170301批、20170302批和20170303 批結核ag85ab DNA 疫苗成品分別稀釋成 0.10 mg·mL-1的溶液，10 000 r·min-1離心后吸取上清，作為供試品 1、供試品 2和供試品 3備用。稱取氯化鈉 9.00 g，磷酸氫二鈉 1.93 g，磷酸二氫鈉 0.44 g，用滅菌注射用水溶解并定容至 1 L，即得到 PBS 對照液。用 PBS 對照液將 20170301 批成品稀釋成 0.10 mg·mL-1的溶液，10 000 r·min-1離心后吸取上清，作為供試品 4 備用。

1.3 色譜條件 色譜柱 TSK-gel DNA-NPR (4.6 mm×75 mm，2.5 μm)；流動相：20 mmol·L-1三羥甲基氨基甲烷(用鹽酸調節(jié) pH至9±0.2)為流動相 A，20 mmol·L-1三羥甲基氨基甲烷-1 mol·L-1NaCl (用鹽酸調節(jié)pH至9±0.2) 為流動相 B；柱溫：25 ℃；流速：0.5 mL·min-1；進樣量：10 μL；檢測波長：260 nm；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.4 方法的驗證

1.4.1 專屬性 取供試品1、供試品4和PBS對照樣品分別按“1.3”項下色譜條件上樣檢測，比對色譜圖，觀察在供試品1主峰出峰位置，供試品4及PBS對照液是否有干擾。

1.4.2 線性 將供試品1用PBS溶液稀釋成0.05、0.10、0.15、0.20和0.25 mg·mL-1，按“1.3”項下色譜條件進樣，每個濃度分別進樣6次。計算供試品的主峰面積，以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性擬合，計算相關系數(shù)。

1.4.3 精密度 重復性：取供試品按照“1.3”項下色譜條件進樣6次，測定主峰面積，計算主峰面積的相對標準偏差(RSD)。

中間精密度：測定不同檢測時間的精密度變化，按“1.3”項下色譜條件進樣方法在3個工作日制備供試品1，按照“1.3”項下色譜條件分別進樣2次，計算主峰面積的RSD。

測定不同實驗員間的精密度變化，2個實驗員分別制備3份供試品1，依“1.3”項下方法進行測定，每個供試品分別測定2次，計算主峰面積的RSD。

測定不同檢測設備間的精密度變化，取供試品1，采用“1.3”項下的方法分別在高效液相色譜儀Agilent 1100 和Agilent 1260 進樣2次，計算不同高效液相色譜儀上供試品主峰面積的RSD。

1.4.4 耐用性 檢測波長耐用性：將“1.3”項下色譜條件的波長條件改為258、260和262 nm，取供試品1分別進樣2次，測定主峰面積；柱溫耐用性：將“1.3”項下色譜條件的溫度條件改為23、25和27 ℃，取供試品1分別進樣 2 次，測定主峰面積；流速耐用性：將 “1.3”項下色譜條件的流速改為0.4、0.5和0.6 mL·min-1，取供試品1分別進樣2次，測定主峰面積；流動相比例耐用性：將“1.3”項下梯度洗脫條件12 min的流動相B 設定值改為64%、66%和68%，取供試品1分別進樣2次，測定主峰面積。

1.4.5 穩(wěn)定性 將新配制的供試品1跟放置24 h后的供試品1分別按“1.3”項下色譜條件進行進樣2次，采用面積歸一化法計算供試品溶液主峰的面積百分比，比較0 h和放置24 h后的供試品溶液主峰純度的變化。

1.4.6 檢測限 取供試品1用流動相A逐級稀釋濃度至 0.01、0.005、0.001 mg·mL-1和0.000 5 mg·mL-1，按濃度由低到高分別進樣3次，分別計算每個濃度的信噪比，如還未達到3∶1，根據(jù)檢測濃度進一步稀釋。

1.5 含量的測定 取供試品1、供試品2和供試品3按“1.3”項下色譜條件進樣2次，采用面積歸一化法計算供試品的主峰面積百分比及RSD。

2 方法與結果

2.1 專屬性研究 從檢測結果可知，PBS對照液除溶劑峰外其他位置未出峰，用流動相A和 PBS配制的供試品主峰保留時間和峰高一致。結果表明輔料磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉和氯化鈉對結核質粒DNA純度的檢測無明顯干擾，專屬性驗證符合要求，結果見圖1。

2.2 線性 結核質粒DNA濃度在0.5～2.5 μg的范圍內，線性擬合系數(shù)R2為0.999 8，表明進樣量與峰面積的線性關系良好。

2.3 重復性 供試品連續(xù)進樣6次的主峰面積RSD為0.30%，表明該法精密度良好。 中間精密度：3個工作日測得結核質粒DNA主峰面積的RSD為0.40%，結果顯示該法不同檢測時間的中間精密度良好。2名實驗員制備供試品測定的主峰面積RSD為0.51%，不同人員間中間精密度良好。2臺檢測設備測得供試品主峰面積RSD為0.23%，表明不同設備間中間精密度良好。

2.4 耐用性 為考察色譜條件的變化對結果的影響，將柱溫、波長、流速和流動相的比例分別設置為不同參數(shù)，結果顯示不同設置下，供試品純度的RSD均<2.0%，表明該法的耐用性較好，詳見表 2。

表2 耐用性研究結果

2.5 穩(wěn)定性 供試品1在0 h時測定的純度平均值為99.44%，在室溫放置24 h后測定的純度平均值為99.20%，不同放置時間純度的RSD為0.14%，結果顯示供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.6 檢測限 0.001 mg·mL-1的供試品測定的信噪比(S/N)為3，因此推測 0.001 mg·mL-1時為該方法的檢測限。

2.7 3批結核ag85ab DNA疫苗樣品的純度檢測結果均大于95%，見表 3。

表3 3批結核ag85ab DNA疫苗樣品的純度測定結果

3 結論

結核治療性DNA疫苗發(fā)揮治療作用的主要成分為質粒DNA，在產(chǎn)品的終產(chǎn)物中，宿主菌的基因組DNA、RNA、蛋白質、內毒素和非超螺旋質粒等雜質均不利于質粒DNA在真核細胞的基因轉染，進而影響藥效作用[23]。因此結核DNA疫苗的純度對終產(chǎn)品是否安全有效起到了重要作用。采用高效液相色譜法分析質粒DNA的純度主要有分子排阻色譜法和離子交換色譜法，分子排阻法對開環(huán)、線性和超螺旋3種構型的質粒DNA無法達到較好地分離，而離子交換色譜柱是根據(jù)組分離子對樹脂親合力不同而得到分離，對不同構型的 DNA也具有一定的分離效果。因此本試驗選用離子交換色譜法對結核治療性DNA疫苗進行純度的分析，并對該方法的專屬性、線性、重復性和穩(wěn)定性等進行驗證。結果表明，該方法用于檢測結核治療性DNA疫苗中質粒DNA的專屬性良好，輔料組分未對目的峰造成干擾，精密度和耐用性測試結果均良好，樣品在24 h內也較穩(wěn)定，驗證表明本試驗建立的結核DNA疫苗純度的檢測方法準確、可靠，能為新型結核DNA疫苗的質量控制提供一定依據(jù)。