葉生小皮傘不同發酵產物對硝酸甘油誘導偏頭痛大鼠的抗炎、鎮痛作用

王 歡,婁 玲,步洪石,陳長寶,*,王淑敏,*,李 玉

(1.長春中醫藥大學,吉林長春 130117;2.吉林農業大學教育部食藥用菌工程研究中心,吉林長春 130118)

偏頭痛是一種常見的慢性神經血管性疾患,這種疾病具有很強的遺傳背景[1],并導致頭痛、畏光、聲音恐懼癥等癥狀。這種疾病在20世紀時被認為由血管引起的[2],全世界受偏頭痛困擾的人數日益增多。目前,偏頭痛的發病機制中,以三叉神經血管學說在偏頭痛病理生理機制中占主導地位[3-4]。而偏頭痛的發生與一氧化氮(NO)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、多巴胺(dopamine,DA)等單胺類遞質的水平密切相關[5-7]。在偏頭痛發作前期,血小板的5-HT釋放因子水平升高,使血小板釋放5-HT,血清中5-HT水平增加,引起顱內血管收縮,引起偏頭痛先兆的前驅癥狀[8-9]。研究表明無先兆偏頭痛發作間歇期,DA水平明顯升高,發作期血小板去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)水平上升[10]。目前,臨床上的治療藥物有非甾體類抗炎藥、阿片類、曲普坦類、麥角類制劑;經皮磁刺激、經皮直流電刺激等非藥物治療[11]。但往往存在副作用,或效果不佳,因此急需開發出有效、安全、耐受良好的新型治療藥物[12]。

硝酸甘油在體內分解為一氧化氮(nitric oxide,NO),NO能激活平滑肌細胞內的腺苷酸環化酶,使環鳥苷酸增高,使血管平滑肌和血管舒張,從而引起神經性的炎癥反應,刺激神經元,參與體內疼痛感覺的傳遞,引發痛覺的發生[8]。因而本實驗采用硝酸甘油誘導的偏頭痛大鼠模型,以大鼠腦組織中單胺類神經遞質5-HT、NE、DA,血清中炎癥因子白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)以及NO的含量作為衡量大鼠偏頭痛的指標[13],研究了葉生小皮傘(Marasmiusepiphyllus)不同發酵產物對硝酸甘油誘導的偏頭痛的作用,填補葉生小皮傘在藥理研究方面的空白,豐富小皮傘屬真菌的藥用資源,為偏頭痛新藥的研發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試菌株ME-1 采自長春凈月國家森林公園,經組織分離純化得到,長春中醫藥大學王淑敏教授鑒定為葉生小皮傘(Marasmiusepiphyllus(Pers.)Fr.);SD大鼠(180～220 g) SPF級,雄性,于遼寧長生生物技術股份有限公司,許可證號為SCXK(遼)2015-0001;硝酸甘油注射液 河南潤弘制藥股份有限公司,批號A180310 G-2;鹽酸氟桂利嗪膠囊 吉林省七星山藥業有限公司,批號20170605;水合三氯乙醛 沈陽市試劑三廠;生理鹽水注射液 遼寧民康制藥有限公司;Rat ELISA kit、一氧化氮(NO)、白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)、5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA) 上海源葉生物技術公司。

ELX-800酶標儀 濟南卓奧醫療器械有限公司;F6/10勻漿機 上海凈信科技;5417R冷凍離心機 德國eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵物提取物的制備 葉生小皮傘菌株ME-1經固體發酵,發酵條件為薏米∶麥麩=2∶1,含水量為80%、接種塊數為6塊,自然pH,發酵溫度(27±1) ℃,發酵20 d,60 ℃烘干備用。固體發酵產物水提物(WESF):葉生小皮傘干燥固體發酵產物,粉碎,加10倍量的水煎煮提取30 min,取其濾液,再加8 倍量的水煎煮提取20 min,取其濾液,最后加6 倍量的水煎煮提取10 min,取其濾液,合并三次濾液,減壓濃縮、蒸干,備用。

葉生小皮傘菌株ME-1經液體發酵,發酵培養基為3%麥芽糖,2%酵母粉,0.15% KH2PO4,0.1% MgSO4·7H2O;發酵條件為:在溫度為(27±1) ℃,轉速為150 r/min,適宜的pH為5～6,最佳裝量為140 mL/500 mL,發酵天數為10 d,60 ℃烘干備用[14]。葉生小皮傘菌絲體水提物(WEM):將液體發酵后所得菌絲,加10倍量的水煎煮提取30 min,濾過,殘渣再加8倍量的水煎煮提取20 min,濾過,殘渣加6倍量的水煎煮提取10 min,合并三次濾液,減壓濃縮,蒸干,備用。葉生小皮傘發酵液(LFP):將液體發酵后的所得的發酵液,減壓濃縮,干燥至恒重。

1.2.2 造模、分組及給藥 適應性喂養后,將SPF級SD大鼠隨機等分成9組,每組10只,空白對照組:生理鹽水1 mL/100 g;模型對照組:生理鹽水1 mL/100 g;陽性藥組(鹽酸氟桂利嗪flunarizine hydrochloride 1.2 mg/kg);葉生小皮傘固體發酵物水提物低劑量組(WESF 200 mg/kg);固體發酵物水提物高劑量組(WESF 400 mg/kg);菌絲體水提物低劑量組(WEM 200 mg/kg);菌絲體水提物高劑量組(WEM 400 mg/kg);發酵液低劑量組(LFP 200 mg/kg);發酵液高劑量組(LFP 400 mg/kg),各組連續灌胃給藥7 d,末次給藥前12 h,禁食不禁水。最后一次給藥1 h后,除空白組皮下給與同樣體積的生理鹽水外,模型組皮下給予硝酸甘油注射液(10 mg/kg)[15-17]。造模30 min后,觀察大鼠行為,觀察頻繁撓頭、雙耳發紅、爬籠情況等現象,判斷造模是否成功[18-19]。

1.2.3 腦組織中5-HT、NE、DA含量測定 取血后,迅速將活體大鼠在冰盤上斷頭,解剖大鼠頭部,并完整取出腦,迅速將大腦、小腦、腦干進行分離,并迅速放入冰盒中,待剝離出完整的腦干組織后,制成10%組織勻漿液,用于測定腦組織中5-HT、NE、DA的含量。

1.2.4 血清中NO、IL-6、IL-β含量測定 在給予造模藥后開始計時,計時4 h后,將大鼠進行統一處理,腹腔給予10%水合三氯乙醛(0.06 mL/kg)用來將大鼠麻醉,用血管及采血針對麻醉好的大鼠用進行腹主動脈取血,采血后將采血管靜置2 h,在4 ℃的高速冷凍離心機內低溫離心10 min(3500 r/min),取上清用于NO、IL-6、IL-1β含量測定。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 葉生小皮傘對偏頭痛大鼠搔頭反應的影響

由表1可看出,與空白對照組相比,模型組大鼠的搔頭次數顯著增加(P<0.001)。與模型組相比,WESF高劑量組、WEM高劑量組及LFP低、高劑量組大鼠的搔頭次數顯著減少(P<0.05,P<0.01,P<0.001),且LFP高劑量組大鼠搔頭次數抑制率最高,可達52.6%。

表1 葉生小皮傘對偏頭痛大鼠搔頭反應的影響

2.2 葉生小皮傘對偏頭痛大鼠腦組織中血管活性物質和神經遞質5-HT、NE、DA水平的影響

2.2.1 葉生小皮傘對偏頭痛大鼠腦組織中5-HT水平的影響 NO、5-HT、DA等單胺類遞質與偏頭痛的發生、發展密切相關。偏頭痛發作前,血漿中5-HT水平急劇升高,顱內血管收縮,偏頭痛發作時,5-HT被單胺氧化酶A迅速代謝為 5-HIAA,引起血管病理性擴張性頭痛[20-21]。

從圖1可以看出,與空白對照組比較,模型組大鼠腦組織中5-HT的水平顯著降低(P<0.001)。與模型組比較,陽性藥組和WESF低、高劑量組、WEM低、高劑量組、LFP低、高劑量組大鼠腦組織中5-HT水平均顯著升高(P<0.001),且各給藥組之間無顯著差異,說明葉生小皮傘發酵產物可有效提高偏頭痛發作時血管活性物質5-HT的含量,減輕血管擴張引起的偏頭痛。

圖1 葉生小皮傘對偏頭痛大鼠腦組織中5-HT水平的影響

2.2.2 葉生小皮傘對偏頭痛大鼠腦組織中NE水平的影響 神經遞質DA和NE的水平與偏頭痛有著密切的聯系,腦血管活動受中樞DA能神經末梢支配。NE和DA代謝紊亂會加劇偏頭痛的發展[22]。從圖2可看出,與空白對照組比較,模型組大鼠腦組織中NE的水平顯著降低(P<0.001)。與模型組比較,陽性藥組和WESF低、高劑量組、WEM低、高劑量組、LFP低、高劑量組大鼠腦組織中NE水平均顯著升高(P<0.001,P<0.05),且各組之間無顯著差異,說明葉生小皮傘發酵產物可以促進腦內神經遞質NE的分泌。

圖2 葉生小皮傘對偏頭痛大鼠腦組織中NE水平的影響

2.2.3 葉生小皮傘對偏頭痛大鼠腦組織中DA水平的影響 從圖3可看出,與空白對照組比較,模型組大鼠腦組織中DA的水平顯著降低(P<0.001)。與模型組比較,陽性藥組和WESF低、高劑量組、WEM低、高劑量組、LFP低、高劑量組大鼠腦組織中DA水平均顯著升高(P<0.01,P<0.001),其中WEM對DA水平的影響最大,LFP次之,WESF影響相對最低,說明不同的發酵方式及提取方法對腦內神經遞質DA的分泌有著很大的影響,本研究中菌絲體水提物對DA的分泌具有很好的促進作用。

圖3 葉生小皮傘對偏頭痛大鼠腦組織中DA水平的影響

2.3 葉生小皮傘對偏頭痛大鼠血清中NO水平的影響

NO具有神經毒性,還可使環鳥苷酸增高,使血管平滑肌和血管舒張,從而引起神經性的炎癥反應,引發痛覺的發生。從圖4可看出,與空白對照組比較,模型組大鼠血清中NO的水平顯著升高(P<0.001)。與模型組比較,除WESF低劑量組、WEM低劑量組外,陽性藥組和WESF高劑量組、WEM高劑量組、LFP低、高劑量組大鼠血清中NO水平均顯著降低(P<0.05,P<0.001),葉生小皮傘發酵物可有效降低血清中NO的水平,緩解神經炎癥及疼痛。

圖4 葉生小皮傘對偏頭痛大鼠血清中NO水平的影響

2.4 葉生小皮傘對偏頭痛大鼠血清中IL-6和IL-1β水平的影響

2.4.1 葉生小皮傘對偏頭痛大鼠血清中IL-6水平的影響 研究表明,腦膜血管擴張及炎癥反應是偏頭痛發病機制中的重要因素,IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的釋放是誘導炎癥反應的重要因素[23]。從圖5可看出,與空白對照組比較,模型組大鼠血清中IL-6的水平顯著升高(P<0.001)。與模型組比較,除WEM低劑量組、LFP低劑量組外,陽性藥組和WESF低、高劑量組、WEM高劑量組、LFP高劑量組大鼠血清中IL-6水平均顯著降低(P<0.05,P<0.001),且各給藥組無顯著差異。

圖5 葉生小皮傘對偏頭痛大鼠血清中IL-6水平的影響

2.4.2 葉生小皮傘對偏頭痛大鼠血清中IL-1β水平的影響 從圖6可看出,與空白對照組比較,模型組大鼠血清中IL-1β的水平顯著升高(P<0.001)。與模型組比較,除LFP高劑量組外,陽性藥組和WESF低、高劑量組、WEM低、高劑量組、LFP低劑量組大鼠血清中IL-1β水平均顯著升高(P<0.05,P<0.001),各給藥組無顯著差異,這說明用葉生小皮傘菌發酵提取物治療后,可顯著降低炎癥反應。

圖6 葉生小皮傘對偏頭痛大鼠血清中IL-1β水平的影響

綜上所述,葉生小皮傘不同發酵方式及提取方法對實驗性偏頭痛大鼠腦組織中血管活性物質和神經遞質5-HT、NE、DA水平均有顯著的影響,對5-HT及NE水平的影響,各組無顯著差異,而對DA的分泌,WEM具有良好的促進作用,效果優于其他給藥組。而WESF高劑量組對偏頭痛大鼠血清中IL-6、IL-1β和NO水平顯示出較好的抑制作用。

3 結論

偏頭痛是一種與5-HT和DA及其受體有關的神經血管疾病[24],血清素(5-HT)及其受體在偏頭痛的發作期和間歇期起著重要作用[25]。在偏頭痛發作時,5-HT的代謝物5-羥基吲哚乙酸(5-HIAA)在尿液中增加,血中5-HT濃度降低,5-HT的降低可引起血管擴張性疼痛以及頭皮血管反彈[26]。近年來發現,NO在偏頭痛中起到極為重要的作用,是引發頭痛發生和發展的始動因子[27],導致血管擴張,也可通過激活三叉神經末梢釋放CGRP誘發神經源性炎癥反應引起偏頭痛[20],釋放IL-1β、IL-6等炎癥因子。

本文初步研究了葉生小皮傘不同發酵產物對硝酸甘油誘導偏頭痛大鼠的抗炎、鎮痛作用。研究結果表明,與模型組相比,給藥組可以顯著降低血清中NO含量,進而減輕血管擴張,緩解偏頭痛。葉生小皮傘不同發酵物可顯著(P<0.05,P<0.001)降低偏頭痛大鼠血清中炎癥因子IL-1β和IL-6的水平,減輕神經源性炎癥反應。同時,與模型組相比,葉生小皮傘各給藥組可顯著(P<0.05,P<0.001)提高下丘腦組織中5-HT、NE、DA的水平。說明葉生小皮傘發酵產物可調節血管收縮及機體的神經遞質分泌,抑制傷害感受信息的傳遞,對偏頭痛大鼠具有良好的抗炎、鎮痛作用,具有開發新藥的可能,為其進一步開發、利用提供理論依據。