美拉德反應產物中三類官能團化合物的質量分布與主體香氣特征

朱龍杰,曹 毅,朱懷遠,吳 洋,張合川,陳晶波,王 瑞,張 華,張 媛,廖惠云

(江蘇中煙工業有限責任公司技術中心,江蘇南京 210019)

美拉德反應是含游離氨基的化合物與還原糖或羰基化合物在常溫或加熱時發生的聚合、縮合等反應,最終生成棕黑色的大分子物質類黑精的一類羰胺反應[1-3]。除產生類黑精外,反應還會生成還原酮、醛和雜環化合物,其中有些物質是食品色澤和風味的主要來源,還有些物質具有獨特的抗氧化性物質[4-7]。因此,美拉德反應產物成為研究的熱點,在食品烘焙[8-9]、釀酒[10]、肉類加工[11-12]、香精生產[13-15]、煙草加香[16]、醫藥[17-19]等領域應用廣泛。

關于美拉德反應產物的分析研究,目前集中于反應條件的優化及美拉德反應產物分析與應用[20-26],多數研究會選擇各自的美拉德反應體系,以及選擇少數幾種糖和少數幾種氨基酸制備美拉德反應產物[18-19,27-29]。但由于不同反應體系下的美拉德反應產物主要組分的質量分數存在差異,且香氣濃度和風味特征也經常產生變化,因此很難根據文獻資料對不同反應體系下的美拉德反應產物的相關組分進行整體類比推導,也很難對美拉德反應產物的香氣濃度和香氣特征進行準確評價。

目前,關于美拉德反應產物的化學組分研究,一般是對反應產物中檢出的所有成分進行定性或定量分析[18-21,23-27]。這通常適用于一種或幾種美拉德反應產物的研究分析,但如果要對多種糖和多種氨基酸制備的不同美拉德反應產物進行分析,就會使得工作量十分巨大。同時,這種研究方法還缺少側重性,即美拉德產物中的成分非常復雜,很多檢測出的有機物盡管含量較大,但香氣卻較弱,如某些小分子的烷烴、醇、醚、酸等物質,對美拉德反應產物的主體香氣特征貢獻較少,因此需要選擇具有較強風味特征和較低香氣閾值的關鍵組分進行重點研究分析。

美拉德反應中存在的芳香族類、雜環類和烯酮(醛)類三大類化合物,風味特征明顯,其氣味強度高和香味閾值低,是具有典型香氣特征的化合物[30-31]。從天然產物中提取的許多芳香族類物質很多都會產出不同的香味特征,在某些氨基酸美拉德產物中,特別是含有苯環的氨基酸的美拉德反應產物中具有很多芳香族類化合物,為美拉德產物提供不同的香氣來源[31]。雜環類化合物的分子中擁有與苯環類似的不飽和的閉環共軛體系,也具有不同程度的芳香性,大多數雜環化合物有極高的氣味強度和極低的香味閾值,因此雜環化合物是美拉德產物的重要致香成分[32]。烯酮類化合物分子中有不飽和雙鍵,根據電子振動理論,其易受氧化還原酶作用,使人體嗅神經末梢細胞產生嗅覺[33]。由于烯酮(醛)同時具有不飽和碳碳和碳氧雙鍵,因此烯醛(酮)類化合物氣味閾值低,香氣更加突出。

本工作擬探討在一個合適的反應體系下,制備多種糖類和多種氨基酸的美拉德反應產物,選擇美拉德反應產物中雜環類化合物、芳香族類化合物和烯醛(酮)類三類官能團化合物的進行定性定量分析,獲取這三類關鍵組分的質量分布規律,并結合美拉德反應產物主體香氣特征的感官評價,準確地解析美拉德反應產物的主體香氣特征,為其在食品、香料等行業的應用體現出更好的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

D-葡萄糖、D-果糖、D-木糖、D-脫氧核糖、D-核糖、D-阿拉伯糖、L-甘氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-谷酰胺、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸、L-半胱氨酸 BR,國藥集團化學試劑有限公司;碳酸鉀、無水硫酸鈉、丙二醇 AR,國藥集團化學試劑有限公司;丙酸苯乙酯 >97%,阿法埃莎化學有限公司;超純水 電阻率≥18.2 MΩ·cm。

ME203電子天平 感量0.001 g,瑞士Mettler Toledo公司;S210型pH計 分辨率0.001,瑞士Mettler Toledo公司;ZNCL-G型智能恒溫磁力攪拌器 河南愛博特科技發展有限公司;R215型旋轉蒸發儀 瑞士Buchi公司;6890N-5975C型氣相-質譜聯用儀 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 美拉德反應體系的優化 丙二醇是一種與水互溶、性質穩定且對環境友好的有機溶劑,在美拉德反應中常用來控制反應體系中水分的比例[14,23]。由于本實驗溫度選擇在100 ℃,以及丙二醇與水組成的混合溶劑具有較高的恒沸點,因此選擇丙二醇作為美拉德反應的主要溶劑。

為解決美拉德反應進程中的酸化現象比較嚴重的問題[34-35]和五碳糖、六碳糖的原料代表性問題,根據前期研究結果,本實驗使用碳酸鉀維持美拉德反應體系的pH為堿性,以葡萄糖、果糖、木糖和脫氧核糖四種非互為光學異構體的單糖作為美拉德反應的糖類原料,將其分別與20種不同氨基酸原料進行兩兩組合反應,共計制備80種美拉德反應產物。

1.2.2 美拉德反應產物的制備 在50 mL的圓底燒瓶中加入5 mmol糖和5 mmol氨基酸,根據氨基酸的類型加入適量碳酸鉀(原料為天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和酪氨酸時,碳酸鉀的添加量為5 mmol;其他氨基酸時,碳酸鉀的添加量為2.5 mmol),維持反應液的pH為堿性。反應溶液為20 mL丙二醇和5 mL超純水,升溫加熱至100 ℃,反應時間為6 h。

1.2.3 美拉德反應產物中三類官能團化合物的檢測 取2 mL美拉德反應液加入含有分液漏斗中,加入含有內標丙酸苯乙酯的二氯甲烷溶液,使用二氯甲烷與水相體系進行振蕩萃取。有機相經分離、無水硫酸鈉干燥、漏斗過濾、旋轉蒸發濃縮后,采用GC/MS進行檢測分析。

氣相色譜條件:色譜柱 Agilent DB-5MS(30 m×0.25 mm,0.25 μm);載氣He;載氣流速1.0 mL/min;進樣口溫度260 ℃;進樣量1 μL,分流比為10∶1;升溫程序:60 ℃ 保持1 min,以10 ℃/min升溫至280 ℃,保持15 min。

質譜條件:電離方式EI;電離能量70 eV;離子源溫度230 ℃;四級桿溫度150 ℃;質量掃描范圍30～450 amu;溶劑延遲3 min。

1.2.4 美拉德反應產物的主體香氣特征描述與感官質量評分 取0.5 mL美拉德反應液溶于5.0 mL乙醇溶劑中,將其存放在10 mL棕色玻璃瓶中,搖勻以備使用。用標準嗅香紙(長140～150 mm,寬5～6 mm),不帶其他氣味。將嗅香紙浸入樣品1～2 cm深,離鼻腔2.5 cm通過鼻孔吸氣,每次2～3 s。評香應在一定間隔時間內進行,蘸后即嗅。記錄每個美拉德反應產物的香氣特征,用生活中常見的類似物質風味特征作一般性描述詞語,其中描述型詞語參考香料評價時常用的修飾詞語[28-31]。

表1 天冬酰胺-果糖美拉德反應產物中官能團化合物種類和質量

根據美拉德反應產物主體香氣的令人愉悅程度和香氣強度兩項對其整體感官質量進行評分。在主體香氣感官質量得分中,令人愉悅程度占0～5分,香氣強度為0～5分,滿分10分。當香氣令人愉悅程度為0分時,即香氣表現出不令人愉悅時,香氣強度不參與評分,該香味物質整體感官質量為0分。

1.3 數據處理

采用GC/MS工作站自帶的Nist 14和Wiley標準質譜圖庫檢索美拉德反應產物中各化合物質譜數據,結合化合物的質譜離子裂解規律和保留時間,對能予以定性(匹配度大于850和可能性大于80%)且屬于三類官能團化合物的組分進行探討。以內標丙酸苯乙酯為基準物質,采用半定量方法設定相關參數[23],利用峰面積歸一化法計算各化合物的相對質量。通過公式(1)計算單一目標化合物的質量,通過公式(2)計算美拉德反應產物中三類官能團化合物的總質量。上述數據均使用Excel 2010數據處理軟件進行計算。

Mi=Ms×Ai/As

式(1)

MT=12.5×ΣMi

式(2)

式中:Mi:i組分的質量;Ms:內標物的質量;Ai:i組分的峰面積;As:內標物的峰面積;MT:美拉德反應產物中三類官能團化合物總質量。

2 結果與分析

2.1 美拉德反應產物中三類官能團化合物的種類分布

以天冬酰胺-果糖美拉德反應產物為例,采用1.2.3的方法對該美拉德反應產物進行GC/MS分析,得到了天冬酰胺-果糖美拉德反應產物總離子流圖,見圖1。

圖1 天冬酰胺-果糖美拉德反應產物總離子流圖

對圖1色譜圖中的各色譜峰進行質譜解析及標準譜庫檢索定性,并計算得到天冬酰胺-果糖美拉德反應產物中屬于三類官能團化合物的物質名稱與質量,參見表1。表1結果顯示,天冬酰胺-果糖美拉德反應產物中共鑒定出20種雜環類官能團化合物,主要為含氮化雜環化合物,包括占主要部分的17種吡嗪化合物以及3種吡啶類化合物。

依次對制備的其他美拉德反應產物中的各組分進行標準譜庫對比和質譜輔助解析,鑒定出屬于雜環類、芳香族類、烯酮(醛)類三大類官能團化合物的香味物質共有64種。對鑒定出的64種香味組分進行匯總,根據每種化合物的分子骨架結構特點,歸納出美拉德反應產物中三類官能化合物的分子骨架圖,見圖2。圖2中Y基團為三類官能化合物分子骨架中某一(幾)點位上的不同取代基,當化合物的分子骨架與不同Y基團組合后,即為美拉德反應產物中已鑒定出的目標化合物。

圖2 美拉德反應產物中三類官能團化合物的分子骨架圖

2.2 美拉德反應產物中三類官能團化合物的質量分布情況和香氣特點

依據2.1中天冬酰胺-果糖美拉德反應產物中三類官能團化合物的種類鑒定和質量計算方法,對制備的80種美拉德反應產物進行種類鑒別和質量計算,得到美拉德反應產物中三類官能團化合物的質量與總質量分布表,其中雜環類化合物質量包括氮雜環化物、氧雜環化合物和硫雜環化合物的質量,詳情見表2～表5。

表2 葡萄糖與氨基酸美拉德反應產物中三類官能團化合物的質量分布

表3 果糖與多種氨基酸美拉德反應產物中三類官能團化合物質量分布

表4 木糖與多種氨基酸美拉德反應產物中三類官能團化合物質量分布

表5 脫氧核糖與多種氨基酸美拉德反應產物中三類官能團化合物質量分布

表2～表5數據顯示,四種糖類美拉德反應產物中,含氮雜環類化合物在所有制備的美拉德反應產物中都有分布,且整體質量分數較高,在美拉德反應產物三類官能團化合物中占有很大比重。鑒定出的含氮雜環化合物中以吡嗪類化合物居多,其他還有一些吡啶類和吡唑類含氮雜環化合物(分子結構參見圖2A1)。在制備的含氮雜環化合物質量分數高的美拉德反應產物中,大部分產物香氣豐富、令人愉悅,擁有比較突出的堅果香、可可香、玉米香、烤土豆香、烘烤香等,代表性的化合物有2,5-二甲基吡嗪、2-乙酰基吡嗪、2-乙酰基吡啶等。

含氧雜環化合物在六碳糖葡萄糖和果糖中略有分布,而在五碳糖木糖和脫氧核糖中比較少(分子結構參見圖2A2)。含氧雜環化合物一般擁有甜香、焦糖香,楓槭香、奶油香等的香氣特征[31,33],代表性的化合物有甲基環戊烯酮醇、3,5-二羥基-6-甲基-2H-吡喃-4(3H)-酮、4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮等。在制備的含氧雜環化合物的美拉德反應產物中,大部分產物都能辨別出具有的特征甜糖香氣,其中葡萄糖美拉德反應產物的甜香要比果糖美拉德反應產物更容易辨認。通過對比表2和表3,分析這可能是因為葡萄糖美拉德反應產物中氧雜環化合物的質量要明顯多于果糖美拉德反應產物中氧雜環化合物的質量。

含硫雜環化合物只存在一些特定的含硫氨基酸美拉德反應產物中。盡管蛋氨酸美拉德反應產物的三類官能團化合物總質量要整體高于半胱氨酸美拉德反應產物,但是蛋氨酸美拉德反應產物中并沒有檢測出含硫雜環化合物。相反,三類官能團化合物總質量較少的半胱氨酸美拉德反應產物中卻檢測出了噻唑類含硫雜環化合物(分子結構參見圖2A3)。由于蛋氨酸中的硫原子只生成開鏈式的含硫化合物,使得該美拉德反應產物有明顯讓人不太愉悅的硫化物氣味。而半胱氨酸的美拉德反應產物由于生成了閉環的含硫雜環化合物,其香氣令人愉快、擴散好、穿透性強,具有烤面包香、爆玉米花、熟蛋香等香味特征,主要代表化合物為2-乙酰基噻唑。

芳香族類化合物主要存在于苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸美拉德反應產物中。其中苯丙氨酸和酪氨酸的美拉德反應產物中小分子的含有苯環的化合物質量分數較為豐富(分子結構參見圖2B),這些芳香族類化合物使得美拉德反應產物透發出比較明顯的花香和辛香,代表性的化合物有苯乙醇、苯乙醛、苯乙酸乙酯等。而色氨酸美拉德反應產物中大分子類芳香族類化合物質量分數較高(分子結構參見圖2B),但該芳香族類化合物種類較為單一,含有苦杏仁氣味,香氣擴散能力一般,香氣不夠飄逸,主要代表性的化合物為2-氨基苊-1(2H)-酮。

烯酮(醛)類化合物主要分布在亮氨酸和異亮氨酸兩種氨基酸美拉德反應產物中。其中在亮氨酸和異亮氨酸美拉德反應產物中主要是開鏈式的烯酮(醛)類化合物(分子結構參見圖2C),其質量分數較豐富,整體香氣也較濃郁,散發出獨特的藥草香、苔香、霉香等香氣,代表性的化合物有(E)-5-甲基-3-烯-2-庚酮、(Z)-2-乙基-2-烯-己醛和(E)-2-異丙基-5-甲基-2-烯-己醛。另一類烯酮(醛)類化合物以五元閉環形式存在于其他一些氨基酸美拉德反應產物中(分子結構參見圖2C),如蛋氨酸、精氨酸等,其特點是質量分數少,造成香氣不夠突出。

2.3 美拉德反應產物的主體香氣特征

組織專業從事香精香料調配人員,對制備的80種美拉德反應產物進行香氣感官評價。選種一種或幾種常見香味物質香氣作一般性描述詞語,對所有美拉德樣品進行香氣感官評價,描述美拉德反應產物的香氣特征,評價結果見表6。

表6 四種糖類與多種氨基酸美拉德反應產物的香氣特征

由表6可知,糖類對美拉德反應產物的香氣類型改變不大,而氨基酸種類則對美拉德反應產物的整體香氣產生比較大的影響。不同氨基酸的美拉德反應產物香氣特征種類較多,有些氨基酸美拉德反應產物的香氣類型比較相似,而有些則差異較大。在眾多香氣類型中,甜香和堅果香是美拉德反應產物中兩類重要的香氣類型。甜香香型在美拉德反應產物中分布較多,不同糖類美拉德反應產物的香氣大都帶有一定的甜香特征,但甜香種類有所區別,其中葡萄糖美拉德反應產物帶有甜糖香韻,果糖美拉德反應產物帶有烤甜香韻,木糖美拉德反應產物帶有清甜香韻,脫氧核糖美拉德反應產物帶有弱甜香韻,其代表性美拉德反應產物有:甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、谷氨酸和酪氨酸美拉德反應產物。堅果香是美拉德反應產物中吡嗪類含氮雜環化合物的代表香味特征,當該類化合物質量分數高時堅果香氣會比較突出,其代表性美拉德反應產物有:天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷酰胺、賴氨酸、組氨酸美拉德反應產物。其余不同氨基酸美拉德反應產物的香氣特征區別較大,各自擁有專屬的香味類型,如藥草香、膏香、谷物香、花香、爆米花香、煙熏香等。

2.4 美拉德反應產物中三類官能團化合物質量和主體香氣感官評分

根據香味評審員對制備的80種美拉德反應產物的主體香氣感官評分,與美拉德反應產物中三類官能團化合物的總質量,從整體上評估兩者的關聯度,結果見表7。

從表7的 4種糖類的美拉德反應產物的橫向對比中看出,果糖的美拉德反應產物中三類官能團化合物總質量高于其他糖類的美拉德反應產物,其主體香氣評分對應的也普遍較高,大部分得分處于6～10分區間。而脫氧核糖的美拉德反應產物中三類官能團化合物總質量較小,其主體香氣評分也較小,大部分得分處于1～5分區間。從表7的不同氨基酸美拉德反應產物的縱向對比中看出,亮氨酸、賴氨酸和苯丙氨酸美拉德反應產物中的三類官能團化合物總質量處于較高水平,其相應的主體香氣評分也較高,得分集中于7～9分區間。而絲氨酸、蘇氨酸、精氨酸等其他氨基酸,由于三類官能團化合物總質量較低使得其主體香氣得分也低,得分集中于2～4分區間。表7還顯示,美拉德反應產物中三類官能團化合物的累計總質量大小關系為果糖>木糖>葡萄糖>脫氧核糖,而其主體香氣的累計得分大小關系依次為果糖>葡萄糖>木糖>脫氧核糖。表7的數據表明,美拉德反應產物中三類官能團化合物的單項總質量和累計總質量與主體香氣評價得分有較好的關聯度。

從表7中可以發現,盡管大部分美拉德反應產物的三類官能團化合物總質量與其主體香氣評分的關聯度較好。但是含硫氨基酸美拉德反應產物較為特殊,其香氣的主體特征由含硫化合物的種類決定。當美拉德反應中的硫原子沒有形成雜環化合物的時候,具有不令人愉悅的含硫氣味,如蛋氨酸美拉德反應產物,雖然其三類官能團化合物總質量較為豐富,但由于產物中含有開鏈式含硫化合物而透發出咸菜味和硫化物氣息,主體香氣不令人愉悅,香氣評分為0分。

表7 美拉德反應產物中三類官能團化合物總質量與主體香氣評分

但當美拉德反應中的硫原子形成閉環含硫雜環化合物的時候,其反應產物則具有令人愉悅的烤堅果,爆米花氣味,評分則較高。例如,果糖-半胱氨酸美拉德反應產物,其三類官能團化合物總質量雖然很少,但由于生成香氣閾值很低的閉環含硫雜環化合物,其香氣具有很強的擴散性和穿透性,主體香氣令人愉悅,香氣評分達到了10分。

3 結論

通過對制備的美拉德反應產物的定性和定量分析,獲得了雜環類、芳香族類和烯酮(醛)類三大類官能團化合物的種類與結構特點,以及三大類官能團化合物的質量分布規律。雜環類化合物尤其是含氮雜環類化合物種類多,質量分數較高,是美拉德反應產物中最重要主體香氣來源。芳香族類和烯酮(醛)類化合物種類不多,質量分數較少,主要分布于幾種特定的美拉德反應產物中,其主體香氣具有各自的特點。

美拉德反應產物中三類官能團化合物的總質量與主體香氣評分具有較好的關聯度。不同糖類美拉德反應產物中三類官能團化合物累計總質量的順序依次為果糖、木糖、葡萄糖和脫氧核糖,其主體香氣的累計評分順序依次為果糖、葡萄糖、木糖、脫氧核糖。不同氨基酸美拉德反應產物中三類官能團化合物總質量較高且主體香氣評分較高的有亮氨酸、賴氨酸和苯丙氨酸美拉德反應產物。含硫氨基酸美拉德反應產物比較獨特,其主體香氣評分與產物中含硫化合物的分子結構形態密切相關。

以美拉德反應產物中三類重要的官能團化合物作為研究對象,獲得其質量分布規律和美拉德反應產物的主體香氣特征,為香精香料和食品加工從業人員更好地應用美拉德反應產物提供了一個有用的技術支撐。