不同前處理方法對食品中罌粟殼檢測效果對比

張虹艷,石曉峰,王小喬,許曉輝,李晨曦,潘秀麗,李 赟

(1.蘭州市食品藥品檢驗所,甘肅蘭州 730050;2.甘肅省醫學科學研究院,甘肅蘭州 730050)

罌粟殼為罌粟科植物罌粟(Papaversomniferum)采完鴉片后的干燥成熟果殼,具有一定的成癮性,標志性成分為罌粟堿、那可丁、可待因、嗎啡、蒂巴因等生物堿[1]。上世紀80年代中期以來,一些不法食品生產經營者為牟取暴利,在火鍋底料、調味料、肉湯中摻用罌粟殼的現象屢禁不止,為此2008年12月衛生部發出《關于開展全國打擊違法添加非食用物質和濫用食品添加劑專項整治的緊急通知》,明確將罌粟殼列入首批非食用物質名單。

表1 5種生物堿的CAS號、化學式、保留時間、離子信息、碎裂電壓、碰撞能信息

國內外文獻報道的罌粟殼檢測方法主要有分光光度法[2]、薄層法[3-4]、氣相色譜法[5-6]、液相色譜法[7-9]、氣相色譜-質譜聯用法[10]、液相色譜-質譜聯用法[11-21]、免疫分析法[22]、化學發光法[23]、毛細管電泳-質譜聯用法[24-25]。前處理方法主要有QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged,safe)法[15,20]和固相萃取法[11-12,18-19],其中QuEChERS法因其快速、便捷、有效等特點被廣泛應用于高通量檢測領域,上海市食品藥品監督管理局2012年發布的地方標準《火鍋食品中罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因和蒂巴因的測定》(DB31/2010-2012)[26],即使用QuEChERS法進行樣品前處理,采用三重四級桿液質聯用儀進行檢測,但因其專屬性不強、凈化不徹底,易造成樣品基質效應增強,必須使用內標法校正,究其原因可能是凈化填料在去除雜質的同時對生物堿也有吸附作用,導致回收率降低,基質效應增強;而固相萃取法可通過選擇性吸附保留生物堿,同時選擇性洗脫干擾雜質,達到對樣品進行分離、凈化和富集的目的。

為了優選對食品中罌粟殼檢測具有普適性的前處理方法,本實驗以罌粟殼添加風險較高且基質較為復雜的火鍋底料、辣椒粉和肉湯為研究對象,采用高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用法,通過對比分析QuEChERS法和兩種不同固相萃取(Oasis MCX和Oasis PRiME HLB)法,優選前處理方法并將其應用到實際食品中罌粟殼的檢測工作中。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗樣品選擇具有代表性的固體樣品、液體樣品和固液混合樣品共計50批次,其中辣椒粉15批次、肉湯10批次、火鍋底料25批次 均購置于當地小吃街;對照品:鹽酸罌粟堿(批號:171214-201205,純度:99.9%)、那可丁(批號:171224-201304,純度:99.9%)、蒂巴因(批號:171216-201304,供含量測定用)、嗎啡(批號:171201-201324,純度:99.1%)、可待因(批號:171203-201304,純度:97.5%) 均購于中國食品藥品檢定研究院;可待因D3與嗎啡D3同位素內標混合溶液20 μg/mL ANPEL公司;乙腈、甲醇 色譜純,默克公司;固相萃取柱Oasis PRiME HLB(60 mg/3 mL)和Oasis MCX(60 mg/3 mL) 美國Waters公司。

1290-6460高效液相色譜-三重四級桿液質聯用儀、1290-6545高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜儀 美國安捷倫;5810R冷凍離心機 德國艾本德;VORTEX KB-3渦旋振蕩器 中國海門其林貝爾;MS105DU電子天平 美國梅特勒;Milli-Q超純水系統 美國Millipore;SBL-10DT超聲機 寧波新芝。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜條件:LC-MS/MS與LC-Q-TOF/MS色譜條件相同。色譜柱:HILIC色譜柱(2.0 mm×100 mm,3 μm);流動相:0.1%甲酸溶液(含10 mmol/L乙酸銨A相)-0.1%甲酸乙腈溶液(B相)。梯度洗脫程序:0～5.0 min,98%～95% B;5.0～6.0 min,95%～90% B;6.0～9.0 min,90% B;9.0～10.0 min,90%～85% B;10.0～12.0 min,85% B;12.0～13.0 min,98% B,13.0～15.0 min,98% B;流速:0.3 mL/min;柱溫:35 ℃;進樣量:2 μL。

1.2.2 質譜條件

1.2.2.1 LC-MS/MS質譜條件 離子源:電噴霧電離(ESI)源,正離子模式;干燥氣溫度:325 ℃;干燥氣流速:6 L/min;霧化器壓力:45 psi;鞘氣溫度:400 ℃;鞘氣流速:12 L/min;毛細管電壓:4000 V。質譜采集參數見表1。

1.2.2.2 LC-Q-TOF/MS質譜條件 離子源:電噴霧電離(ESI)源,正離子模式;干燥氣溫度:320 ℃;干燥氣流速:8 L/min;霧化器壓力:35 psi;鞘氣溫度:350 ℃;鞘氣流速:11 L/min;毛細管電壓:3500 V;全掃描范圍:m/z 50～1000;參比離子m/z 121.0509和922.0098(用于實時校正)。

1.2.3 混合對照品溶液的配制 準確稱取罌粟堿、那可丁、可待因、嗎啡、蒂巴因對照品各10.00 mg,分別用0.5%甲酸甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶,得到濃度均為1 mg/mL的5種生物堿對照品的儲備液,于-18 ℃冰箱中保存。精密移取對照品儲備液適量于10 mL容量瓶中,用乙腈定容至刻度,配制成罌粟堿、那可丁、蒂巴因濃度為1.0 μg/mL和嗎啡、可待因濃度為5.0 μg/mL的混合對照品溶液。

精密移取可待因D3與嗎啡D3同位素內標混合溶液1 mL置于5 mL容量瓶,用甲醇溶解并定容,配制成可待因D3與嗎啡D3濃度均為4 μg/mL的同位素內標工作溶液。

1.2.4 樣品前處理

1.2.4.1 QuEChERS法 對于不同種類的固體和液體火鍋底料采用相同的取樣方式,將火鍋底料中的油脂、香辛料和調味料等充分混合,制成樣品組成均一的待測樣。參照DB 31/2010-2012[26]中的實驗方法,稱取上述試樣2 g(精確至0.01 g)于50 mL聚四氟乙烯具塞離心管中,加入50 μL同位素內標工作溶液,火鍋底料和肉湯加入5 mL水,振搖使分散均勻,辣椒粉加入0.1 mol/L鹽酸溶液5 mL,超聲處理30 min(超聲功率300 W,超聲頻率40 KHz),用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH呈中性,火鍋底料、肉湯和辣椒粉均精密加入10 mL乙腈,再分別渦旋振蕩1 min,加入6 g無水硫酸鎂和1.5 g無水醋酸鈉的混合粉末,迅速振搖,再渦旋振蕩1 min,以4000 r/min離心5 min,取上清液待凈化。

稱取PSA 50±5 mg、無水硫酸鎂100±5 mg、C18粉末100±5 mg,置于2 mL聚四氟乙烯具塞離心管中,移取上述待凈化上清液1.5 mL至此離心管中,渦旋混合1 min,以10000 r/min轉速離心2 min,移取上清液,0.22 μm濾膜過濾,取濾液待測。

1.2.4.2 固相萃取法(Oasis PRiME HLB) 對于不同種類的固體和液體火鍋底料采用相同的取樣方式,將火鍋底料中的油脂、香辛料和調味料等充分混合,制成樣品組成均一的待測樣。稱取上述試樣2 g(精確至0.01 g)于50 mL聚四氟乙烯具塞離心管中,準確加入20 mL含0.2%甲酸的乙腈,旋渦混合30 s,超聲提取5 min(超聲功率300 W,超聲頻率40 kHz),以5000 r/min離心5 min,精密移取上清液2.0 mL過PRiME HLB小柱,用10 mL乙腈洗凈小柱殘留,吹干柱床收集全部濾液。濾液經氮氣吹干后,準確加入1.0 mL含0.2%甲酸的乙腈溶解殘渣,過0. 22 μm有機相濾膜,待測。

1.2.4.3 固相萃取法(Oasis MCX) 對于不同種類的固體和液體火鍋底料采用相同的取樣方式,將火鍋底料中的油脂、香辛料和調味料等充分混合,制成樣品組成均一的待測樣。稱取上述試樣2 g(精確至0.01 g)于50 mL聚四氟乙烯具塞離心管中,準確加入20 mL含0.2%甲酸的乙腈,旋渦混合30 s,超聲提取5 min(超聲功率300 W,超聲頻率40 kHz),以5000 r/min離心5 min,精密移取上清液2.0 mL,通過用5 mL甲醇、5 mL水活化后的固相萃取Oasis MCX小柱,再依次用5 mL水和5 mL 50%甲醇水溶液(V∶V)淋洗,棄去全部流出液,減壓抽干;然后用10 mL 5%氨化甲醇(V:V)洗脫,洗脫液經氮氣吹干后,準確加入1.0 mL含0.2%甲酸的乙腈溶解殘渣,過0.22 μm有機相濾膜,待測。

以上樣品同時做3份平行樣,以保證結果的準確可靠。

1.2.5 方法學驗證

1.2.5.1 標準曲線的繪制 精密移取上述混合對照品溶液適量于容量瓶中,用乙腈溶解并定容至刻度,配制成罌粟堿、那可丁、蒂巴因濃度為0.2、0.4、1、2、4、10 μg/L,嗎啡、可待因濃度為1、2、5、10、20、50 μg/L,內標溶液濃度為20 μg/L的系列對照品溶液。依“1.2”項下LC-MS/MS的色譜和質譜條件進樣測定,然后以5種生物堿的濃度(X,μg/L)為橫坐標,質譜響應強度(Y)為縱坐標進行線性回歸,繪制標準曲線。

1.2.5.2 檢出限 精密移取混合對照品溶液適量加入空白基質中,通過三種前處理方法,在最優實驗條件下進行實驗,加標濃度逐級遞減,至恰好能滿足3倍信噪比時,計算檢出限(LOD)。

1.2.5.3 回收率和精密度 精密移取混合對照品溶液2、20、100 μL加入火鍋底料、辣椒粉和肉湯空白基質中,配制成罌粟堿、那可丁、蒂巴因質量濃度分別為1、10、50 μg/kg,嗎啡、可待因質量濃度分別為5、50、250 μg/kg的加標樣品,每個濃度平行實驗6次,QuEChERS法需加入50 μL同位素內標工作溶液,通過三種前處理方法,在最優實驗條件下進行實驗,計算回收率和相對標準偏差(RSD)。

1.2.6 基質效應 基質效應的存在主要會影響樣品中生物堿定量分析的準確性。樣品前處理的目的是減小樣品中其他組分對生物堿準確定量的干擾,但也有可能引入其他外源性成分,因此不同的前處理過程對基質效應也有不同程度的影響[27]。本研究對比QuEChERS和固相萃取法(Oasis PRiME HLB和Oasis MCX)對火鍋底料、辣椒粉和肉湯前處理后色澤的影響,同時分析不同方法提取效果的差異。

在火鍋底料、辣椒粉和肉湯中加入不同濃度的生物堿進行前處理,繪制基質標準曲線。分別精密吸取混合對照品溶液2、4、10、20、40、100 μL，加入火鍋底料、辣椒粉和肉湯空白基質中,按3種方法進行前處理,配制成那可丁、罌粟堿、蒂巴因質量濃度均為1、2、5、10、20、50 μg/kg,可待因和嗎啡質量濃度均為5、10、25、50、100、250 μg/kg的基質標準曲線;與基質標準曲線濃度對應,混合對照品溶液用乙腈稀釋并定容至刻度,配制成罌粟堿、那可丁、蒂巴因濃度為0.2、0.4、1、2、4、10 μg/L,嗎啡、可待因濃度為1、2、5、10、20、50 μg/L的系列對照品溶液,繪制溶劑標準曲線,然后按下列公式(1)進行計算,評估基質效應。

式(1)

式中:ME為基質效應;A為基質標準曲線斜率;B為溶劑標準曲線斜率。ME>0,表明基質效應增強,ME<0,表明基質效應抑制。|ME|=0表示不存在基質效應,|ME|<0.2為弱基質效應,0.2≤|ME|≤0.5為中等基質效應,|ME|>0.5為強基質效應。

1.2.7 方法的應用與驗證 采用固相萃取法(Oasis MCX)對50批次市售火鍋底料、辣椒粉、肉湯等樣品進行前處理,在最優實驗條件下進行實驗,其中1批次石鍋雞湯檢出那可丁、罌粟堿、蒂巴因和嗎啡4種生物堿。為了驗證Oasis MCX固相萃取法的可靠性,將該陽性樣品分別用QuEChERS和固相萃取法(Oasis PRiME HLB和Oasis MCX)進行前處理后,比對分析檢測結果。

表2 5種生物堿的線性方程、決定系數、線性范圍和檢出限

在“1.2”項下HPLC-Q-TOF/MS的色譜和質譜條件下,以全掃描模式(MS mode)對濃度為1.0 μg/mL的5種生物堿的混合對照品溶液進行分析,獲得各成分精確的相對分子質量、同位素信息和保留時間,導入PCDL軟件建立一級譜庫。然后將陽性樣品使用固相萃取法(Oasis MCX)前處理,將處理好的樣品進行一級質譜全掃描,與PCDL軟件中已經建立好的數據庫進行自動檢索,通過精確質量數、保留時間、同位素分布和同位素比例4個指標進行匹配度打分,匹配度為60分以上的成分為疑似可能添加物。

2 結果與分析

2.1 方法學考察結果

5種生物堿的線性方程、相關系數、線性范圍和檢出限見表2,回收率試驗結果見表3。結果表明,5種生物堿中罌粟堿、那可丁、蒂巴因在0.2～10 μg/L、可待因、嗎啡在1～50 μg/L濃度范圍內呈良好的線性,決定系數(R2)均大于0.9994。采用QuEChERS法和固相萃取法(Oasis PRiME HLB和Oasis MCX)分別對樣品進行前處理測得的檢出限分別為0.1～5.0、0.1～8.0、0.1～5.0 μg/kg。對于不同的生物堿種類,基于火鍋底料、麻辣粉和肉湯3種不同的食品基質,采用不同的前處理方法其檢出限存在差異,其中那可丁使用以上3種前處理方法處理火鍋底料、辣椒粉和肉湯,其檢出限均為0.1 μg/kg、罌粟堿檢出限均為0.2 μg/kg、蒂巴因檢出限均為0.2 μg/kg,可待因使用以上3種前處理方法處理火鍋底料、辣椒粉和肉湯,檢出限范圍為2.0～4.0 μg/kg,嗎啡使用以上3種前處理方法處理火鍋底料、辣椒粉和肉湯,檢出限范圍為2.0～8.0 μg/kg,可待因和嗎啡在不同食品基質中的檢出限存在較大差異。采用QuEChERS法和固相萃取法(Oasis PRiME HLB和Oasis MCX)分別對樣品進行前處理測得回收率和RSD值分別為70.6%～105.3%,64.2%～116.9%,73.6%～102.5%和2.0%～8.5%,1.6%～8.3%,1.6%～7.8%(n=6),固相萃取柱Oasis MCX處理火鍋底料、辣椒粉和肉湯回收率和RSDs均最理想,Oasis MCX固相萃取法相比于另外兩種方法,更適用于辣椒粉、肉湯和火鍋底料3種具有代表性的固體樣品、液體樣品和固液混合樣品中5種生物堿的提取和凈化。

2.2 不同前處理方法的基質效應

火鍋底料和辣椒粉屬于麻辣食品,均具有較深的色澤,通過前處理達到吸附食品中油脂、色素以及其他干擾物的目的,不同吸附材料對不同食品基質中生物堿的吸附性能存在差異,如圖1所示。對比不同基質提取物,辣椒粉色澤最深、火鍋底料次之、肉湯色澤最淺,辣椒粉中存在較多天然色素,通過前處理方法難以達到徹底去除的目的,影響基質的凈化效果。對于同一種食品基質,通過Oasis MCX固相萃取凈化的食品基質色澤最淺、QuEChERS法次之、HLB色澤最深。可見,前處理去除色素能力由強到弱依次為Oasis MCX法、QuEChERS法、Oasis PRiME HLB法。

圖1 3種方法處理后的基質提取物

表3 5種生物堿的加標回收率和精密度(n=6)

采用QuEChERS法和固相萃取法(Oasis PRiME HLB和Oasis MCX)3種方法處理火鍋底料、辣椒粉、肉湯3種不同食品基質,評價5種生物堿的基質效應,結果見表4,發現采用QuEChERS法進行前處理,26.7%的化合物為弱基質效應,沒有強基質效應的化合物，基質效應為0.12%～0.44%;采用Oasis PRiME HLB法進行前處理,66.7%的化合物為弱基質效應,13.3%的化合物為強基質效應，基質效應為0.02%～0.82%；采用Oasis MCX法進行前處理,73.3%的化合物為弱基質效應,沒有強基質效應的化合物，基質效應為0.07%～0.41%;結果表明消除基質干擾效果由優到劣依次為Oasis MCX法、QuEChERS法、Oasis PRiME HLB法。導致差異的原因可能是QuEChERS法為固體分散吸附劑,易吸附干擾物,使用內標校正,可有效降低基質效應;Oasis PRiME HLB含有特定比例的親水基和疏水基,對生物堿和基質雜質均有一定保留能力,專屬性差,不能有效去除基質干擾;Oasis MCX將磺酸基鍵合在高度交聯的PS/DVB表面得到的混合型陽離子吸附劑,具有反相和強陽離子交換雙重保留性能,對堿性物質有良好的選擇性和靈敏度,而罌粟殼的主要成分為生物堿,生物堿大多是氮雜環結構,具有一定的堿性,Oasis MCX比Oasis PRiME HLB表現出了更加優越的分離富集性能。

表4 3種方法處理后的基質效應

2.3 方法應用與結果驗證

在最優實驗條件下,用固相萃取法(Oasis MCX柱)對50批次的市售樣品進行前處理,經檢測后發現,其中1批次石鍋雞湯含有那可丁、罌粟殼、蒂巴因和嗎啡4種成分。采用3種前處理方法檢測該陽性樣品,對比結果見表5,發現Oasis MCX固相萃取檢測結果與DB 31/2010-2012更為接近,DB 31/2010-2012針對不同食品基質采用不同QuEChERS前處理方法,需要內標校正,內標物(尤其是有證書的標準物質)不易得到,增加了檢驗成本,方法通用性不強。Oasis MCX固相萃取技術可作為一種低成本普適性的方法應用于食品中罌粟殼的定性定量檢測。該方法使用0.2%甲酸的乙腈溶液作為提取液并使用Oasis MCX固相萃取方法,可以提高提取效率,同時適用于固體、液體和固液混合食品基質中生物堿的提取凈化,具有較好的通用性。

圖2 陽性樣品HPLC-Q-TOF/MS總離子流圖和質譜圖

表5 陽性樣品測定結果

通過高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜儀進行結果驗證,其結果如圖2所示,檢出罌粟殼4種生物堿成分,一級質譜匹配度良好,那可丁檢索得分99.26,罌粟堿檢索得分99.65,蒂巴因檢索得分80.93,嗎啡檢索得分99.72,進一步確確認以上陽性樣品檢出那可丁、罌粟堿、蒂巴因、嗎啡4種生物堿。

3 結論

本研究通過對比分析3種應用較多的前處理方法QuEChERS法和固相萃取法(Oasis PRiME HLB和Oasis MCX)對不同食品基質火鍋底料、辣椒粉和肉湯中5種生物堿的萃取效果,采用高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用法進行檢測,并使用高分辨質譜HPLC-Q-TOF/MS對檢測結果進行驗證。3種不同食品基質中,其中火鍋底料油脂較多,前處理需去除大量油脂,辣椒粉是固體粉末,對生物堿有明顯吸附作用,存在較強基質效應,嗎啡和可待因兩種生物堿尤為明顯。與現行的地方標準(DB31/2010-2012)相比,Oasis MCX固相萃取法無需使用內標校正,前處理方法具有普適性,基質效應低,檢出限低,回收率高,同時有效避免假陽性結果發生。本研究通過對比優選了食品中罌粟殼檢測的普適性前處理方法,為打擊罌粟殼非法添加行為提供技術參考。