云南邊貿進口即食食品中蠟樣芽胞桿菌污染狀況及其嘔吐毒素基因型檢測

何俊蓉,陳 蕓,李云飛,關鼎儒,范 青,呂廷保,晏明興,鄔瑋航,朱仁俊,*,胡永金,*,楊玲春,*

(1.云南農業大學食品科學技術學院,云南昆明 650201;2.昆明海關技術中心,云南昆明 650228;3.昆明海關,云南昆明 650051)

蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus,B.cereus)是芽胞桿菌屬的一員,為革蘭氏陽性菌,兼性需氧,可形成芽胞,無莢膜。引起食物中毒的菌株,多為周生鞭毛,有動力[1]。

表1 各口岸采集樣品種類和數量

B.cereus是一種重要的食源性致病菌,該菌廣泛存在于各類食品中,極易污染富含淀粉的食物,特別是大米、面食以及糕點餅干類食品,除此之外,其還能污染蔬菜、乳制品以及肉制品等[2-6]。其引起的食物中毒分為2種類型:腹瀉型和嘔吐型,分別由腹瀉毒素和嘔吐毒素引起[7]。腹瀉型毒素至少由5類毒力因子構成:溶血性腸毒素HBL(hbl)、非溶血性腸毒素Nhe(nhe)、細胞毒素K(cytK)、腸毒素T(bceT)以及腸毒素FM(entFM)[8-12]。嘔吐型毒素(Cereulide)是一種環形的小分子肽,由ces基因編碼,熱穩定性強,可以耐受極端酸堿性,具有極強的抗胃蛋白酶及胰島素的蛋白水解作用,會導致肝細胞損傷、肝功能衰竭,進而導致死亡[13-14]。在Cereulide生物合成基因簇中,嘔吐毒素合成酶基因cesB在其中扮演了重要角色。有研究表明,攝入被嘔吐型毒素污染的食物后,在0.5～6 h內會發生惡心和嘔吐,并有腹瀉、頭暈、四肢無力等癥狀,嚴重時能導致死亡,危害最大[15-17]。曾有1例瑞士男孩因食用含有大量嘔吐毒素的食物引發急性肝衰和橫紋肌溶解的死亡病例[5]。在我國由B.cereus引起的食物中毒事件時有發生,主要是由嘔吐毒素污染引起的[18]。

在我國B.cereus的檢測主要參照GB 4789.14-2014《食品微生物學檢驗 蠟樣芽胞桿菌檢驗》[19]進行,同時也常采用其他快速檢測方法對其進行檢測。國家質量監督檢驗檢疫總局發布的《2010-2014年中國進口食品質量安全狀況》[20]中指出,微生物污染導致的食品安全問題最為突出,但是目前為止,國內關于進出口食品致病菌污染情況的研究報道較少,進出口食品中食源性B.cereus的研究報道幾乎為零。

本研究從云南省邊貿口岸的邊民互市點、農貿市場及進出口產品店等地共采集224份食品樣品,對其中的B.cereus進行了分離鑒定,并同時檢測其嘔吐毒素基因cesB,以期了解邊貿進口市售食品中B.cereus的污染分布情況及嘔吐毒素基因攜帶情況,為邊貿進口食品食源性疾病的監測及預防提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

即食食品樣品 2018年9月～2019年7月,分別從云南4個邊境口岸:天保、金水河、瑞麗和畹町口岸的邊民互市點、農貿市場及進出口產品店等地采集不同種類的進口市售包裝224份即食食品樣品,采樣數量見表1、表2;甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂培養基(MYP)、蠟樣芽胞桿菌顯色培養基、酪蛋白瓊脂、胰酪胨大豆羊血(TSSB)瓊脂 廣東環凱微生物科技有限公司;BCL鑒定卡 梅里埃診斷產品(上海)有限公司;細菌DNA提取試劑盒、致病性蠟樣芽胞桿菌核酸雙重實時熒光PCR檢測試劑盒 北京卓誠惠生公司。

表2 進口國家(地區)和樣品數量

AC2-5S1生物安全柜 ESCO Airstream公司;LTI-700W恒溫培養箱 BOXUN公司;DK-8AD恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司;Bagmixer 400cc均質器 法國INTERSCIENCE公司;VITEK 2 compact system全自動微生物鑒定系統、PREVI Color Gram全自動革蘭氏染片儀 生物梅里埃公司;ABI 7500實時熒光PCR儀 ABI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蠟樣芽胞桿菌分純培養和生化鑒定 所有采集樣品的前處理均在潔凈條件下進行,參照 GB 4789.14-2014《食品微生物學檢驗 蠟樣芽胞桿菌檢驗》[19]。生化反應呈陽性的菌株進一步使用全自動微生物鑒定系統VITEK 2 compact進行種屬鑒定。

1.2.2 雙重實時熒光PCR鑒定蠟樣芽胞桿菌及其嘔吐毒素型基因

1.2.2.1 細菌基因組DNA的制備 使用接種環挑取瓊脂上培養18～24 h的單菌落,用 DNA 提取試劑盒提取細菌基因組 DNA作為實時熒光PCR反應的模板,具體操作按照產品說明書進行。待基因組DNA提取完畢后,滅菌水作為參比,取適量提取的DNA置于核酸蛋白測定儀上,進行濃度測定。

1.2.2.2 引物及探針 本文蠟樣芽胞桿菌特異性引物及探針均由北京卓誠惠生公司合成,具體引物探針信息見表3。

表3 雙重實時熒光PCR引物及探針序列

1.2.2.3 雙重實時熒光PCR反應體系及反應條件 根據北京卓誠惠生公司的致病性蠟樣芽胞桿菌核酸雙重實時熒光PCR檢測試劑盒(A2292-50T)推薦的反應體系和循環參數,建立20 μL雙重實時熒光PCR反應體系,其中包括6 μL無核酸酶水,10 μL 2×PCR mix,2 μL樣品DNA模板,2 μL 10×引物探針反應液,反應條件如表4所示。

表4 雙重實時熒光PCR的反應條件

2 結果與分析

2.1 分離、鑒定結果

通過分離純化、雙重實時熒光PCR以及全自動微生物鑒定系統對蠟樣芽胞桿菌分離鑒定,在224份邊貿進口市售即食食品樣品中共檢出45份蠟樣芽胞桿菌陽性樣品,檢出率為20.09%(45/224);從45份生化檢測陽性樣品中共篩選出生化實驗陽性菌113株,對分離得到的生化實驗陽性菌進行持家基因gyrB的檢測,結果表明生化實驗陽性菌的gyrB基因檢出率為100%(113/113),進一步確證了生化實驗的結果。各口岸蠟樣芽胞桿菌陽性樣品檢出情況為:天保10份,檢出率為10.53%(10/95);金水河4份,檢出率為40%(4/10);瑞麗26份,檢出率為23.64%(26/110)及畹町5份,檢出率為55.56%(5/9);其中蠟樣芽胞桿菌陽性樣品檢出率最高的為畹町口岸,金水河和瑞麗次之,最低的為天保口岸。

各進口國樣品中蠟樣芽胞桿菌檢出情況為:緬甸最高,陽性樣品份數為29份,檢出率為36.25%(29/80);越南和秦國檢出率次之，最低為其他進口國(地區),未檢出陽性樣品,詳細信息如表5。雖然越南、緬甸和泰國同屬于發展中國家,但是緬甸目前經濟、衛生發展水平遠不如越南和泰國[21],而且本次市場中購買的緬甸食品多為手工加工產品,食品包裝簡陋,無形中增加了食物被蠟樣芽胞桿菌污染的概率。

表5 不同進口國樣品中蠟樣芽胞桿菌檢出情況

在各種類樣品中,除醬腌菜、水產及其制品以及調味品的高檢出率外,分別為:60%(3/5)、46.67%(7/15)以及50%(15/30),其他類別依次為:巧克力及糖果(制品)檢出率為26.67%(8/30)、糧食制品檢出率為20%(4/20)和堅果和籽類檢出率為12.5%(2/16)等,詳細信息見表6。由表6可以看出,除報道中極易受蠟樣芽胞桿菌污染的糧食制品、蔬菜、乳制品、肉制品等,本次實驗還發現蠟樣芽胞桿菌在調味品、醬腌菜、水產品及其制品中檢出率也較高。

表6 各種類樣品中蠟樣芽胞桿菌檢出情況

2.2 嘔吐型蠟樣芽胞桿菌檢出情況

從陽性樣品中篩選出的113株蠟樣芽胞桿菌,嘔吐毒素cesB基因檢測結果顯示,攜帶cesB基因陽性菌株1株,檢出率為0.88%(1/113)。且該株蠟樣芽胞桿菌cesB基因陽性菌株分離自越南即食糕點&面包中,在即食糕點&面包中的檢出率為20.00%(1/5),在越南進口陽性食品樣品中檢出率為3.03%(1/33),結果見表7、表8。蠟樣芽胞桿菌雙重實時熒光PCRcesB基因檢測結果見圖1。

圖1 蠟樣芽胞桿菌雙重實時熒光PCR cesB基因檢測結果

表7 各種類樣品中蠟樣芽胞桿菌cesB基因檢出情況

表8 不同進口國樣品中蠟樣芽胞桿菌cesB基因檢出情況

3 結論與討論

隨著我國進出口食品貿易額穩步上升,邊貿食品的安全性問題逐漸進入人們的視線之中。目前我國對邊貿食品微生物污染狀況的研究較少,但是現有研究表明,邊貿食品存在被微生物污染的風險。王夢琦等[22]曾對吉林省出入境食品中細菌總數、大腸菌群、致病菌、霉菌和酵母菌染狀況進行分析,最終得出吉林省出入境8類食品中存在著微生物污染風險。何成偉等[23]對越南預包裝小食品中的沙門菌、志賀菌、金黃色葡萄球菌、菌落總數、大腸菌群等微生物指標進行檢測,結果顯示越南預包裝小食品中存在菌落總數超標的問題。

蠟樣芽胞桿菌作為一種常見的食源性致病菌,在各類食品中檢出率都較高,如Lan等[24]對中國內蒙古原料奶中蠟樣芽胞桿菌進行了污染狀況分析,結果發現原料乳中蠟樣芽胞桿菌檢出率高達34.4%。Yim等[25]對從首爾零售店購買的88份韓國發酵大豆產品中的蠟樣芽胞桿菌進行了流行情況分析,檢出率為53.40%。王君[18]在所采7大類食品樣品(合計1150 份)中均檢出了蠟樣芽胞桿菌,檢出率由高到低依次為:蔬菜(40.4%)、熟食(26.1%)、速凍食品(23.4%)、肉和肉制品(22.6%)、食用菌(21.7%)、奶制品(17.1%)和水產品(17.0%)。當食品保存溫度不當或存放時間過長時,蠟樣芽胞桿菌或殘存芽胞的生長繁殖,均可引發人胃腸疾病,導致食物中毒[26]。

本研究從云南各口岸共計采樣224份進口市售即食食品,其中蠟樣芽胞桿菌陽性樣品檢出率為20.09%(45/224),比李毅[27]、倪剛[28]以及田萬帆等[29]的研究結果低,從中可以看出不同地區、不同食品中的蠟樣芽胞桿菌檢出率存在差異。其中畹町口岸蠟樣芽胞桿菌陽性樣品檢出率(55.56%)高于其余三個口岸;在四個口岸中,天保和金水河口岸對口越南,瑞麗和畹町口岸對口緬甸,各口岸均有大量的東南亞進口食品流入,如:越南食品、緬甸食品、泰國食品以及其他東南亞國家的進口食品。各進口國家食品中蠟樣芽胞桿菌檢出率依次為:越南15.58%(12/77)、緬甸36.25%(29/80)、泰國6.35%(4/63)以及其他進口國中未檢出。從檢出情況來看,蠟樣芽胞桿菌陽性樣品檢出率偏高,這可能與特殊的生產加工工藝和該國食品工業基礎相對薄弱,食品安全法規、標準尚不夠健全,對食源性疾病的防范和有毒有害物質的風險控制能力有限相關,與云南接壤的東南亞國家除部分大型食品廠外,絕大多數食品加工場所為小作坊式生產。因而食品在加工過程中,極易受到污染或二次污染。從本文檢測結果來看,醬腌菜、水產品及其制品以及調味品中蠟樣芽胞桿菌的檢出率較為突出,說明這三種樣品在其加工工藝或銷售過程中易受蠟樣芽胞桿菌的污染。

云南口岸進口市售即食食品中蠟樣芽胞桿菌cesB基因攜帶率(0.88%)比劉成誠[2]、游興勇等[15]的研究相對較低。224份樣品中檢出嘔吐型蠟樣芽胞桿菌的樣品為糕點&餅干類,由越南進口。有研究表明,“嘔吐綜合癥”幾乎僅與含淀粉的食物有關,特別是煮熟的米飯[30]。本文結果與之前的研究結果相一致。以上研究表明邊貿即食糕點&餅干類食品中存在著嘔吐型蠟樣芽胞桿菌污染的食品安全風險。因此,相關部門應加強邊貿即食食品中該致病菌的監管。

綜上,云南口岸邊貿進口即食食品中存在蠟樣芽胞桿菌污染的風險,其中以調味品、醬腌菜、水產及其制品以及糧食制品中污染風險較大,且在糕點&面包食品中發現了嘔吐毒素基因攜帶情況,通過本研究獲得的數據將對以后邊境食品的監控以及食源性疾病的防控、預警提供理論依據。