溶磷菌組合WF542的篩選及多菌劑聯合對辣椒的促生作用

韓亞杰,李玉嬌,呂曉晨,何詩琪,艾柯代姆·穆海麥提,馬小寧

(1.石河子大學化學化工學院,新疆石河子 832003;2.新疆庫爾勒市第十一中學,新疆庫爾勒 841000;3.石河子大學農學院,新疆石河子 832003;4.新疆農墾科學院農業農村部食品質量監督檢驗測試中心,新疆石河子 832000)

磷是植物生長發育所必需的大量營養元素之一,當植株體內缺磷,蛋白質核酸、輔酶等重要生物分子的合成都會受到影響,進而導致植物分枝減少,植株矮小。化合態中的磷由于與土壤中的Fe3+,Ca2+和Al3+等結合形成難溶磷酸鹽[1],導致土壤中95%以上的難溶性磷源不能直接被植物吸收利用[2]。為了達到增產增收的目的,每年必須向農田土壤施入大量的可溶性磷肥[1]。磷肥利用率低不僅造成嚴重的資源浪費,還會使大量的磷素積累在土壤中,從而導致農田及水體污染、農產品品質下降。隨著人們環保意識的加強,發展生態農業,生產安全、營養、綠色的農產品成為21世紀世界農業發展的主流。目前科學家們潛心研究傳統化學肥料的替代品。微生物菌肥技術是提高磷肥利用率最為有效的方法之一,對農業的可持續發展和環境保護具有重要意義,其中的溶磷菌是復合微生物菌肥的重要組成部分[3]。

溶磷微生物之間存在著各種關系,比如競爭關系、互利關系和中立關系等。溶磷微生物可以通過多菌株的互利共生關系實現其特定的生物學功能。張志鵬等[4]以復合微生物菌劑施加黃瓜,相比空白對照組黃瓜產量增加了43.63%～58.34%。李靜等[5]篩選的復合菌組合(PSM01+PSM12+PSM16)在提高土壤有效磷含量和促進玉米植株生長方面效果顯著。由此可見多菌株組合,能得到促生性能更強的復合系統。

本研究對5株溶磷菌進行鑒定,平板對峙法篩選溶磷菌組合并對其特性進行分析,盆栽實驗研究不同菌劑組合對辣椒幼苗的促生作用,為開發微生物肥料提供有價值的種質資源,以此達到資源的充分利用,實現發展綠色農業改善農產品品質的目標。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

HSYQ18、SYC3、WS54、FWG2和SCPG-7等5株溶磷菌 由實驗室篩選獲得;褐球固氮菌(Azotobacterchroococcum)CICC21685 購自中國工業微生物菌種保藏管理中心;辣椒種子 新疆吉豐種業有限公司;LB液體(固體)培養基 蛋白胨10 g,酵母粉5 g,NaCl 5 g,加蒸餾水至1000 mL,pH7.0～7.2,121 ℃滅菌30 min,(20 g瓊脂粉),冷卻后備用;馬鈴薯糖瓊脂培養基(PDA) 馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂15～20 g,蒸餾水1000 mL,115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min;Pikovskaya培養基(PKO)[6]葡萄糖10 g,Ca3(PO4)220 g,(NH4)2SO40.5 g,NaCl 0.3 g,KCl 0.3 g,MgSO4·7H2O 0.3 g,FeSO4·7H2O 0.03 g,MnSO4·4H2O 0.03 g,蒸餾水1000 mL,pH7.0～7.5,121 ℃濕熱滅菌20 min。

UV-2100紫外可見分光光度計 優尼柯(上海)儀器有限公司;5418R冷凍離心機 德國Eppendorf公司;LRH-150恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;ZQZY-70BS恒溫振蕩器 上海知楚儀器有限公司;MLS-3750高壓滅菌鍋 日本三洋公司;SW-CJ-ZFD超凈工作臺 上海博訊實業有限公司;GZX-9140MBE電熱鼓風干燥箱 上海博訊實業有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶磷菌的鑒定 理化性質及形態學分類:按照文獻[7]做形態與生理生化分析。以細菌16S rDNA用引物27f(5′-AGAGTTTGATC-CTGGCTCAG-3′)和1492 r(5′-CGGTTACCTTGT-TACGACTTC-3′)進行PCR擴增。反應條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,54 ℃ 30 s,72 ℃ 1.5 min,共35個循環;7 ℃ 10 min[8]。將PCR擴增產物提交生物公司進行測序。將測序結果輸入到NCBI數據庫中進行BLAST比對[9]。

1.2.2 溶磷菌組合的篩選及特性

1.2.2.1 溶磷菌株之間的拮抗實驗 將5株溶磷菌(HSYQ18、WS54、FWG2、SYC3和SCPG-7)在LB液體培養基上活化,移取100 μL菌懸液均勻涂布在PDA固體培養基上,然后將其它4株菌分別用接種環接種至已經涂布菌懸液的PDA平板上,28 ℃下培養3 d后檢查結果,觀察相互之間有無抑菌圈[10]。

1.2.2.2 溶磷菌組合WF542的溶磷能力的測定 將50 mL液體PKO無機磷培養基裝入150 mL三角瓶,121 ℃滅菌20 min,冷卻后,分別將500 μL各待測菌株菌懸液(108cfu/mL)接種至三角瓶中[11]。每菌株設3個重復,以基礎培養基(不接種菌株)為對照。將上述三角瓶置于28 ℃、180 r/min搖床培養5 d后,將培養液在10000 r/min、4 ℃離心15 min,取上清液,用鉬銻抗比色法測定溶磷量[12]。

1.2.2.3 溶磷菌組合WF542分泌嗜鐵素及IAA的測定 菌株分泌IAA的能力采用Glickmann的實驗方法[13]測定。采用含鉻天青S的CAS瓊脂平板檢測菌株產生的嗜鐵素。觀察菌落周圍是否有淡黃色的暈圈產生[6]。分別用溶磷菌組合(WF542)的滅活菌液(CK)作為對照,定性檢測溶磷細菌分泌鐵載體能力。

1.2.2.4 溶磷菌組合WF542對溫度、pH、鹽分等生態因子的反應 將LB液體培養基分裝至錐形瓶中,121 ℃滅菌30 min,備用。將OD600為1.0的WF542菌液以2%的接種量加至LB液體培養基中,溫度梯度為10、15、20、25、30、35、40、45 ℃,恒溫振蕩培養箱中培養10 h,每個溫度平行測定3次。分光光度計測量每個溫度下的菌懸液λ=600 nm吸光度,確定溶磷菌組合的最適生長溫度[14]。

表1 五株溶磷菌的生理生化特性

表2 石蕊牛奶實驗

將LB液體培養基分裝至錐形瓶中,分別用1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl依次調節pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0,121 ℃滅菌30 min,備用。將OD600為1.0的WF542菌液以2%的接種量加至LB液體培養基中,每個pH平行測定3次,恒溫振蕩培養箱中培養10 h,每個pH平行測定3次。分光光度計測量每個pH下的菌液λ=600 nm吸光度,確定溶磷菌組合的最適生長pH。

在LB固體培養基中加入NaCl配成1%、3%、5%、7%、9%濃度梯度,滅菌后制成平板備用。將OD600為1.0的WF542菌液200 μL以涂布法接種于各鹽濃度的LB固體培養基上,每個處理重復3次,以不接種的為對照,置28 ℃下培養7 d,觀察菌體生長情況。

1.2.3 多種菌劑的組合盆栽實驗

1.2.3.1 不同菌株的拮抗實驗 將溶磷菌WS54、FWG2,褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)CICC21685活化培養后在新的LB平板上劃線培養,培養6～12 h,挑取菌落制成菌懸液備用在8 ℃低溫冰箱中低溫冷凍保存。將純化的固氮菌,溶磷菌組合斜面接種于裝盛無菌的LB液體培養基中置于30 ℃,220 r/min搖床中培養成菌懸液。培養12 h。

不同菌株之間的拮抗反應是將菌株在LB固體培養基上兩兩相交劃線,放于37 ℃的恒溫箱中培養1～2 d,觀察菌落兩兩之間交叉點的生長情況,如果兩細菌在交叉點處的生長情況良好,說明這兩株菌可以在一起生長,適合做混合菌液,如果兩株菌在交叉點處的生長情況弱或者是不生長的話,說明這兩株菌不適合在一起生長,不適合做混合菌液[15]。

1.2.3.2 多種菌劑組合對辣椒的促生效果 篩選出形狀一致、無明顯缺陷的辣椒種子,使用75%的酒精表面滅菌兩次,每次持續3 min,后使用無菌水沖洗三次。將表面滅菌的種子置于溶磷菌菌液中30 ℃恒溫振蕩12 h后種植在滅菌的鹽堿土中,種植深度3 cm,初次澆水50 mL。種子發芽后澆處理過的菌液(溶磷菌組合WF542、固氮菌、固氮菌+溶磷菌組合WF542)。實驗設置5組平行,并設置對照組。20 d后記錄種子發芽時間、株高等信息。

1.3 數據處理

采用Origin軟件進行數據處理與繪圖,所有樣品均測量3次,取平均值并給出標準偏差。

2 結果與分析

2.1 溶磷菌的形態及生理生化測定

2.1.1 溶磷菌的鑒定 SYC3和SCPG-7菌落均為淺黃色,菌落呈圓形,邊緣完整,平坦,很濕潤,不透明,光滑,生長較快;WS54、FWG2和HSYQ18均為白色,菌落呈圓形,邊緣呈鋸齒狀,有凸起,比較濕潤,不透明,光滑,生長較快。

2.1.2 生理生化鑒定 對5株溶磷細菌的各項生理生化鑒定項目包括:氧化酶實驗、觸酶實驗、明膠液化實驗、淀粉水解實驗、甲基紅實驗、乙酰甲基甲醇等。5株菌的各項生理生化結果見表1和表2。

表3 基于16S rRNA序列分析的BLAST結果

由于細菌具有的酶系統各不相同,因此對營養基質的分解能力也不一樣。用生化試驗的方法可以鑒定細菌對基質的代謝及代謝產物,進而鑒別細菌的種屬。不同細菌含有發酵不同碳源的酶系,有的產酸產氣,有的產酸不產氣。某些細菌具有膠原酶,促使明膠分解。氧化酶實驗主要用于腸桿菌科細菌與假單胞菌的鑒別。觸酶又稱過氧化氫酶,大多需氧和兼性厭氧菌均產生過氧化氫酶。甲基紅試驗是用于鑒別大腸埃希菌與產氣腸桿菌,當細菌發酵葡萄糖產生酸性物質促使培養基的pH小于4.5,為甲基紅試驗陽性。若細菌代謝葡萄糖產酸量少,促使培養基的pH大于6.2,為甲基紅試驗陰性。V.P試驗主要測定細菌利用葡萄糖產生非酸性或中性末端產物的能力,不產生紅色化合物者為陰性反應。由表1和表2可以初步判斷HSYQ18,SYC3是腸桿菌科細菌;而FWG2、WS54、SCPG-7是假單胞菌屬。

2.2 16S rRNA鑒定

將PCR擴增產物提交生物公司進行測序。將所測16S rRNA序列登陸 http://www.EzTaxon.org進行BLAST比對,獲得同源性數值,探討目的菌株的親緣性[9]。5個菌株通過 BLAST比對,都能在數據庫中找到同源性非常高的相似菌株序列,因此,綜合5株溶磷細菌的培養特征、生理生化特性、和BLAST結果分析,初步判斷HSYQ18為深紅沙雷氏菌(Serratiarubidaea),SYC3屬于分散泛菌(Pantoeadispersa),WS54、FWG2和SCPG-7為假單胞菌(Pseudomonas)。

2.3 溶磷菌組合的篩選及菌株特性

2.3.1 溶磷菌株之間的拮抗實驗 微生物間的拮抗作用,一般是指一種微生物的生命活動或其代謝產物,抑制或干擾另一種微生物生命活動的現象。拮抗試驗是鑒定菌株間遺傳差異的傳統方法,是其不同遺傳特性和親和群的重要表現[16]。本研究供試菌株間拮抗反應測試結果表明HSYQ18不能與FWG2和WS54共存,SYC3也不能與WS54共存。共生的菌有HSYQ18+SYC3,SYC3+FWG2,WS54+FWG2,可用于制作混合接種液。分散泛菌SYC3和深紅沙雷氏菌HSYQ18需做致病性試驗方可確定其生物安全性,因此本實驗選用WS54+FWG2為溶磷菌組合,簡稱WF542。

圖1 溶磷菌株之間的拮抗實驗圖

2.3.2 溶磷菌組合WF542的溶磷能力的測定 試驗結果如圖2所示,溶磷菌組合(WF542)在液體培養基中的溶磷量為420～530 mg/L,溶磷菌組合(WF542)在1～4 d內隨著時間的延長,溶磷量逐漸升高,在第4 d的時候溶磷量達到最大為530 mg/L,隨后溶磷量略有下降,曲線呈現先上升后下降的趨勢。分析其原因,曲線先上升可能是因為微生物在其代謝過程中分泌質子酸化介質后產生的釋磷作用所致,由于培養介質酸度的提高或部分有機酸的螯合作用可能使難溶性化合物溶解。曲線后下降可能是因為培養基中合成的各種次生代謝物使有效磷被重新固定所致[17-20]。

圖2 5 d溶磷量動態變化

2.3.3 溶磷菌組合WF542分泌嗜鐵素及IAA的性能 微生物產生植物激素類物質如吲哚-3-乙酸,可促進植物根系有效地吸收土壤中的水分和養分,促進植物的生長發育,并調控植物體其他的生命活動[20-21];微生物分泌鐵載體,在缺鐵的土壤環境中鐵載體螯合鐵離子形成螯合物,在滿足微生物自身生長需要的同時,也能夠被植物直接吸收利用,改善植物的鐵營養狀況[22-23],從而促進植物生長[24]。將配制好的CASAD 嗜鐵素平板打孔后接種菌液,恒溫培養24 h后產生黃色暈圈,如圖3所示,溶磷菌組合(WF542)可以分泌嗜鐵素。由IAA曲線的回歸方程y=0.0294x+0.0854(R2=0.9922),計算溶磷菌組合分泌的IAA濃度為15.7 g/mL。

圖3 菌株WF542產生嗜鐵素性能的比較

2.3.4 溶磷菌組合WF542對溫度、pH、鹽分等生態因子的反應 溫度、pH和鹽分濃度對菌體生長影響很大,在微生物發酵的過程中要嚴格控制溫度,pH和鹽分濃度才能有最大的有效活菌數[25]。溫度是影響生物有機體生長和存活最重要的因素,它可以從不同的方面對生物體內所進行的許多生物化學反應產生影響[26],如圖4所示,實驗測得溶磷菌組合(WF542)的最適溫度在35 ℃左右,在10 ℃時生長較慢,在20～25 ℃之間變化比較大,45 ℃時幾乎不生長;pH是衡量溶液酸堿性的尺度,也是反映微生物溶磷的影響因素之一。如圖5所示,溶磷菌組合(WF542)在pH在5.5～8.0之間都能生長,比較適合在中性的條件下生長,在pH為4.0的時候基本不生長,從pH8.0～9.0生長開始下降說明菌株在培養的過程中能分泌一些酸類物質使pH降低;NaCl在維持滲透壓方面起著重要作用,Na+與細胞膜成分發生特異作用而增強了膜的機械強度,有利于細胞膜結構的穩定。如表4所示,溶磷菌組合(WF542)在鹽濃度為1%、3%的濃度下都能生長,生長情況都為良好,溶磷菌組合WF542在5%鹽濃度下生長一般,在7%的鹽濃度下生長較差,到9%的鹽濃度下不生長,說明溶磷菌組合(WF542)耐鹽性一般。

圖4 溫度對溶磷菌組合WF542生長的影響

圖5 pH對溶磷菌組合WF542生長的影響

表4 不同鹽分濃度對各菌株的影響

2.4 多種菌劑的組合盆栽實驗

2.4.1 不同菌種的相互拮抗實驗的結果 利用平板對峙法研究了5株溶磷菌間的拮抗作用,固氮菌+WS54、固氮菌+FWG2、SCPG-7+固氮菌、SCPG-7+WS54以及SCPG-7+FWG2在混合培養基上共培養2 d后的菌落形態如圖6所示。固氮菌+WS54、固氮菌+FWG2、SCPG-7+固氮菌、SCPG-7+WS54以及SCPG-7+FWG2之間不存在拮抗反應,可以兩兩混合,進行盆栽實驗。

圖6 不同菌株之間的拮抗實驗

2.4.2 多種菌劑組合對辣椒的促生效果 在溫室條件下,將WF542、固氮菌、固氮菌+WF542、空白對照分別接種辣椒種子,接種后20 d測定平均株高(PH)和發芽率(FW)。結果如圖7顯示,接種處理平均株高和發芽率均超過了空白對照。尤其是平均株高,接種處理顯著(P<0.05)高于空白對照。以上說明固氮菌+溶磷菌組合WF542對辣椒的促生效果最明顯,發芽率為84.1%,平均苗長為4.2 cm,組合處理效果比單一菌株好。

圖7 盆栽實驗結果

3 討論與結論

溶磷菌作為有益微生物在活化土壤磷素,促進植物在低肥力土壤生長方面起著較為重要的作用[27-28],溶磷微生物能夠推動土壤中有效磷的釋放,從而促進植物生長發育增加作物產量[29],利用解磷微生物對土壤磷分解,是提高土壤磷有效化利用的重要途徑之一[30]。本研究篩選獲得的溶磷菌組合(WF542)溶磷量最大可達510 mg·L-1,高于李靜(273.44 mg·L-1)[5]、王志剛(140.26 mg·L-1)[3]等分離的無機磷溶解菌的最高溶磷量，這可能與本研究選用混合菌株有關,復合菌株具有比單一菌株更好的溶磷效果。

本研究用于盆栽實驗的溶磷菌株分別歸屬于假單孢菌(Pseudomonas)、中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)。其中假單胞菌屬(Pseudomonas)是目前報道的土壤中溶磷效果較強的菌種之一[31],選用的菌株對辣椒的促生效果以及平均株高都高于空白對照,這與其它研究結果相似[32],說明篩選出的菌株在改善辣椒品質、提高辣椒產量方面具有良好的開發潛力和應用前景。

劉青海等[8]研究的六株溶磷菌和四株固氮菌對苜蓿促生效果研究中表明,混合菌株較單菌株能更好的促進苜蓿對氮磷的吸收并且具有比單菌株更強的耐酸堿和耐鹽性;李靜等[5]篩選的復合(PSM01+PSM12+PSM16)在提高土壤有效磷含量和促進玉米植株生長方面效果顯著;沈麗英等[33]研究的復合微生物新型肥料對作物生長的影響結果表明,復合微生物肥料可使辣椒產量增加13%,腐植酸螯合微量元素肥復合微生物肥料具有促進肥料的吸收達到提早采收的功效,且有減緩肥料的傷害作用。由此可以發現多種菌群聯合作用對植物的促生作用相當明顯且對植物具有生防作用,分析其原因,這可能是多種菌群聯合通常是通過多種途徑協同作用促進植物生長[34],將具有不同促生功能的菌株復合接種后,能協同作用,提高其對植物生長的促進能力[8];Paulsen等[35]確定了熒光假單胞菌Pf-5的完整基因組序列,并突出標明了在生物學控制或根際定植中具有已證明或擬議作用的基因島,結果表明,生物防治劑可保護植物免受疾病侵害為微生物農業生產力的提高奠定基礎。因此,在后續研究中應該加強對多菌劑聯合促生植物效果的研究。

本實驗室篩選的5株溶磷菌株WS54,SYC3,FWG2,HSYQ18和SCPG-7都為革蘭氏陰性菌。HSYQ18為深紅沙雷氏菌(Serratiarubidaea),SYC3屬于分散泛菌(Pantoeadispersa),WS54、FWG2 和SCPG-7為假單胞菌(Pseudomonas)。溶磷菌組合WF542具有分泌嗜鐵素與IAA的能力,溶磷菌組合WF542的最佳生長溫度為35 ℃,在pH為5.5～8.0之間都能生長,在鹽濃度大于9%時不生長。固氮菌、WF542、固氮菌+WF542對辣椒的促生效果均高于空白對照組,其中固氮菌+WF542組合對辣椒的促生效果最為明顯,發芽率為84.1%,平均苗長為4.2 cm。