可視化跨越式滾環等溫擴增技術在豬肉摻假檢測中的應用

胡學佳,盧 鑫,張蘊哲,徐 慧,楊 倩,趙崢山,李子英,蘇玲玲,張 偉,,3,*

(1.河北農業大學食品科技學院,河北保定 071000;2.河北農業大學理工學院,河北滄州 061100;3.河北農業大學生命科學學院,河北保定 071000)

肉及肉制品營養豐富,蛋白質含量高,含有多種人體必需氨基酸,可增強人體免疫力[1]。然而,由于不同肉類之間存在的價格懸殊,一些不法商販為了獲得較高的經濟利潤,用便宜的肉類代替昂貴的肉類[2-3]。近些年,肉類摻假事件層出不窮,因此公眾越來越關注肉制品的質量和安全,同時也意識到肉類摻假帶來的危害[4]。豬肉由于其顏色和質地與羊肉和牛肉相似,且供應充足、價格低廉,因此常被不法商販作為牛羊肉產品的替代品[5-6]。在肉制品中未經標識而添加豬肉的摻假行為不僅損害了消費者的利益,而且威脅到了消費者的宗教習俗(如穆斯林教徒),甚至會對豬肉過敏者的生命造成危害[7-9]。在中國,根據1553家媒體的調查報告顯示肉類摻假數量占食品摻假總數的37.78%[10]。由此可見,肉類摻假問題已經成為我國面臨的重要問題。

表1 豬cyb t基因的引物

為了保護消費者權益,保障公眾健康,人們已經開發了許多可以鑒定肉類產品的技術,這些技術大多通過蛋白質、脂類、揮發性化合物或DNA對肉類進行檢測[11-14]。與其他技術相比,基于DNA的技術的優勢在于其具有更強的熱穩定性,對加工處理后的樣品敏感性更高[15-16]。目前基于DNA的鑒定方法有實時熒光定量PCR技術(real-time PCR)[17],限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)[18],環介導等溫擴增技術(LAMP)等[19]。PCR方法在物種檢測中靈敏度高,重復率高,然而,PCR方法需要繁瑣的操作和昂貴的設備,不適合快速檢測[20-21]。LAMP作為一種新型的等溫擴增技術,可快速、靈敏地對肉制品摻假成分進行檢測,但LAMP需要4～6個引物,引物設計復雜,且引物之間容易發生反應,容易導致假陽性[22-23]。因此,迫切需要一種快速、可靠、易于操作的方法對肉類摻假進行檢測。

近幾年,跨越式等溫擴增技術(Saltatory rolling circle amplification,SRCA)作為一種省時、簡便的方法已成功用于病原菌的檢測[24-25]。SRCA技術主要利用2條引物,在強鏈置換能力的DNA聚合酶的作用下在體外進行等溫擴增反應[26]。與傳統PCR相比,SRCA技術操作不需要繁瑣的變溫過程和昂貴的儀器,且擴增時間短,是快速鑒定物種的理想工具。與LAMP比較,SRCA簡化了引物設計過程,節省了約50%的檢測成本。由此可見,SRCA技術在物種鑒定方面具有很大的發展潛力。本研究采用SRCA技術,建立了針對豬肉成分的檢測方法,針對豬的線粒體基因篩選特異性引物,以特異性、敏感度來評價方法的有效性。本研究旨在對肉制品中的豬肉成分進行快速和可視化檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬肉、兔肉、鴨肉、鵝肉 購自保定當地市場;豬肉、蝦、雞肉、牛肉、牛肉丸、牛肉卷、醬牛肉、牛肉干、牛肉粒、牛肉水餃、羊肉包子、羊肉卷、羊排、羊肉餡餅、羊肉、羊肉串 購自保定超市;牛肉火腿、羊肉干、五香醬羊肉 購自淘寶;血液、細胞和動物組織基因組DNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司;DNA片段回收試劑盒、BstDNA聚合酶 北京全式金生物技術有限公司;BamhI限制性內切酶 大連寶生物工程有限公司;SYBR Green I染料 北京索萊寶科技有限公司;引物 北京華大基因公司。

DK-8D三孔電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司;Nanodrop 2000分光光度計 美國Thermo scientific公司;TGL16A臺式離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司;PCR擴增儀 美國Applied biosystems公司;DXY-33A 型電泳儀 北京六一儀器廠;JY04S-3E 凝膠成像儀 北京君意電泳設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 取豬、牛、馬、蝦、山羊、兔、雞、鴨、鵝等9種不同動物的新鮮肌肉組織樣本。將各待檢肉樣分別單獨放入攪拌器中制成肉泥,再利用液氮將其研磨成均勻糊狀,最后將處理好的動物組織樣本保存于-20 ℃,直至提取DNA。

1.2.2 DNA提取 分別取100 mg各動物組織樣品,使用血液、細胞和動物組織基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。利用Nanodrop 2000分光光度計測定基因組DNA濃度和純度,最后將DNA基因組保存在-20 ℃直至使用。

1.2.3 引物設計 線粒體基因由于其分布的普遍性、序列和結構的相對保守性而被廣泛的應用于物種的鑒定。因此本研究選用線粒體cybt基因序列(GenBank登錄號:FJ160763.1)為豬肉檢測的目的基因,利用DNAMAN軟件進行引物設計。最后,由北京華大基因合成引物。豬肉SRCA反應的特異性引物見表1。

1.2.4 SRCA與PCR的反應條件和程序 SRCA反應總體系為20 μL,包括MgSO4(2.5 mmol/L),dNTPs(2.5 mmol/L),10×ThermoPol緩沖液(2 μL),正反向引物(1 μmol/L),DNA模板(2.5 μL),和BstDNA聚合酶(8 U),無菌去離子水將體系補足至20.0 μL。然后將反應體系混合液置于94 ℃水浴鍋中預變性3 min,冰浴2 min,再于62 ℃水浴鍋中反應60 min,最后在80 ℃水浴鍋中反應5 min以終止反應。

PCR的反應體系總體積共25 μL,包括DNA模板(1 μL),10 μmol/L正反向引物(1 μL),2×Taq PCR Master Mix(11 μL),無菌去離子水將體系補足至25 μL。PCR反應程序為:經95 ℃預變性5 min,然后在94 ℃變性1 min、55 ℃退火45 s、72 ℃延伸45 s之間進行30個循環,循環完畢后于72 ℃再延伸45 s。

1.2.5 SRCA擴增產物的序列分析 為了確定SRCA擴增產物為目的片段,本研究對SRCA產物進行酶切和測序分析。使用BamhI 1 μL,10×Buffer 2 μL,豬的擴增產物1 μL,無菌去離子水補足至20 μL,37 ℃孵育1 h。最后,將豬的酶解產物經2%瓊脂糖凝膠電泳,觀察電泳條帶。同時,將擴增片段送至北京華大基因公司進行測序。

1.2.6 靈敏度試驗 為了確定SRCA方法檢測豬肉DNA的靈敏度。本研究使用無菌去離子水將豬肉DNA進行10倍梯度稀釋,最終豬肉的模板DNA濃度范圍為6.5×107～6.5×10-1fg/μL。最后采用凝膠電泳和熒光可視法觀察試驗結果,并對試驗結果進行重復驗證。

1.2.7 人工污染模擬樣品 為了驗證SRCA方法的準確性且更好的模擬市場中摻假豬肉的現象。本研究將豬肉按100%、10%、1%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0(w/w)的比例添加到牛肉中,制備摻假樣品。分別利用SRCA和PCR兩種方法檢測牛肉中摻假的豬肉。

1.2.8 商業樣品驗證 本研究在中國保定農貿市場及超市收集了66種沒有標識豬肉成分的商業肉類產品,通過與行業標準(NY/T 3309-2018)檢測的豬肉成分結果相比較,確定SRCA反應的敏感性、特異性和準確性。所有的檢測都重復三次。靈敏度、特異度和準確度計算公式如下[24]:

敏感性(%)=真陽性/(真陽性+假陰性)×100

特異性(%)=真陰性/(真陰性數+假陽性)×100

符合率(%)=(真陽性+真陰性)/(真陽性+假陰性+真陰性+假陽性)×100

1.3 數據處理

普通SRCA和普通PCR結果通過電泳圖譜分析,熒光可視化SRCA通過觀察熒光信號進行分析。每個樣品至少重復3次實驗。

2 結果與分析

2.1 SRCA反應結果分析

將SRCA反應擴增產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳進行觀察,SRCA陽性擴增產物長度呈階梯狀增加(圖1A),而陰性對照(沒有模板)不顯示擴增條帶。通過添加熒光染料SYBR Green I觀察SRCA擴增結果,如圖1B所示,陽性樣品(管2)肉眼可見綠色熒光,陰性對照(管1)保持原來的橙色。

圖1 SRCA反應擴增產物分析

2.2 SRCA擴增產物的測序和酶切分析

通過測序分析SRCA陽性擴增產物,測序結果(圖2A)與引物設計的cybt基因具有100%的同源性,證明SRCA擴增產物中含有目標序列的串聯重復單位。為更加全面的驗證SRCA擴增產物是否均按照上述規律擴增,本研究利用BamHI限制性內切酶對SRCA擴增產物進行酶切分析。根據測序結果計算可知,酶切產物是由大量的78 bp DNA片段和少量43和31 bp DNA片段組成。從圖2B可知,43和31 bp DNA片段大小相近,因此在凝膠電泳上不能分離,但酶切產物與測序結果中計算出來的結果大致符合。因此,測序分析和限制性內切酶驗證結果均表明,SRCA擴增產物是通過豬的cybt靶序列特異性擴增得到的。

2.3 引物特異性

SRCA引物的選擇是決定檢測特異性的重要因素。選取9個已知的肉類(包括豬肉)來檢測引物的特異性。結果如圖3A所示,豬肉DNA的SRCA擴增產物(泳道2)呈現出典型階梯狀陽性擴增條帶,牛肉、馬肉、蝦肉、山羊肉、兔肉、雞肉、鴨肉和鵝肉DNAs的SRCA擴增產物(泳道3～10)均未見擴增條帶,呈陰性結果。SRCA熒光可視法的特異性結果如圖3B所示,豬肉模板的擴增產物(管2)顯示綠色熒光為陽性結果,其它肉類模板的擴增產物均為陰性結果呈橙色。結果表明,本研究選用的引物在SRCA反應中對豬肉DNA具有明顯的特異性。

圖2 SRCA擴增產物序列分析結果

圖3 豬肉的SRCA引物特異性分析

2.4 SRCA的檢測靈敏度

靈敏度的測定是建立SRCA方法的第一步。首先,將豬肉模板進行10倍梯度稀釋,然后取1 μL稀釋后的DNA模板進行反應。如圖4A所示,當豬肉模板濃度為6.5×107～6.5×101fg/μL時,擴增條帶明顯,小于6.5×101fg/μL時則不顯示擴增條帶,因此,SRCA凝膠電泳法檢測豬肉的靈敏度為6.5×101fg/μL;熒光可視化法檢測豬肉DNA靈敏度的結果如圖4C所示,模板濃度在6.5×107～6.5×100fg/μL時,擴增產物顯示綠色熒光,小于此濃度范圍則呈橙色,由此可得,SRCA熒光可視法檢測豬肉成分的靈敏度為6.5×100fg/μL;PCR法檢測豬肉DNA,隨著豬肉DNA的濃度逐漸減小,擴增條帶逐漸模糊變暗,直至6.5×102fg/μL擴增條帶消失不見,所以,PCR法檢測豬肉DNA的靈敏度為6.5×103fg/μL(圖4B)。結果表明,SRCA熒光可視法的靈敏度比電泳法高10倍,比常規PCR法高1000倍。

圖4 SRCA靈敏度分析

2.5 人工污染牛肉中豬肉的檢測

牛肉中豬肉的摻加比例為100%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%和0(w/w)。SRCA反應結果如圖5A所示,當豬肉的添加量為100%～0.01%時,擴增條帶清晰可見;當豬肉添加量小于0.01%時,則觀察不到擴增條帶。熒光可視法檢測結果如圖5C可見,當豬肉添加量為100%～0.01%時,SRCA擴增產物均顯示綠色熒光,當豬肉添加量為0.005%時,熒光信號消失,呈橙色。PCR法檢測豬肉含量范圍為100%～0.1%時,擴增條帶清晰可見,豬肉含量小于0.1%時,擴增條帶不顯示。結果表明,SRCA熒光可視法可檢測出0.01%的豬肉含量,而PCR法僅能檢測出0.1%的豬肉含量。

2.6 NY/T 3309-2018及SRCA方法對實際肉制品中豬肉檢出率的比較與分析

本研究利用NY/T 3309-2018方法及建立的SRCA方法對實際購買的66份肉制品進行檢測,通過NY/T 3309-2018方法檢出含豬肉的真陽性樣品數為35個,SRCA方法檢出含豬肉的真陽性樣品數目為36個。與NY/T 3309-2018方法相比,計算可得SRCA方法的敏感性為100.00%,特異性為96.66%,符合率為98.48%(表2)。

表2 SRCA方法評價

3 結論與討論

隨著消費者的消費水平日益提高,肉制品的質量成為消費者選擇肉制品的重要因素。但是肉制品摻假事件層出不窮,為了保護消費者利益,維護市場公平,本研究建立了一種新的檢測肉制品中的豬肉成分的分子生物學方法。該技術只用一對引物,在Bst DNA聚合酶的作用下進行擴增。與PCR相比,SRCA反應不需要熱循環儀,在水浴鍋等恒溫儀器中即可完成擴增,反應體系更加簡單;與LAMP相比,SRCA引物設計方便,同時避免了由于引物交錯導致不能有效的擴增目的片段的問題,此外,SRCA的擴增產物可以通過測序來驗證結果的正確性。與RCA相比,SRCA不需要鎖式探針進行環化,節約成本,操作簡單,同時能夠實現熒光可視化的檢測,避免了繁瑣的電泳過程,節約時間。

圖5 人工污染模擬樣品豬肉成分SRCA分析

目前有研究表明線粒體存在于大多數細胞中,且線粒體基因在種屬間具有高度特異性和保守性,故可達到較高靈敏度而易于種源的研究[28]。因此,本研究針對豬肉的線粒體cyb t基因設計合成了SRCA引物進行擴增,實驗結果顯示該引物對豬肉DNA特異性高。

本研究建立了一種快速、靈敏的SRCA熒光可視法檢測肉制品中的豬肉摻假的方法,該方法的靈敏度為6.5 fg/μL,可檢測出豬肉含量為0.01%的樣品。SRCA熒光可視法僅需一對引物就可以進行特異性擴增反應,不需要昂貴的熱循環儀,并且可以避免電泳的使用,因此,該方法靈敏度高,特異性強,縮短了檢測時間,降低了檢測成本,為肉制品摻假的檢測提供了新方法。綜上所述,SRCA熒光可視法在物種鑒定方面具有巨大的應用價值。