川西高原野櫻桃果酒發酵條件優化及其風味成分分析

雷 丹,吳 敏,胡 瓊,唐 潔,張 慶

(西華大學食品與生物工程學院,四川成都 610039)

川西高原野櫻桃又名苦櫻桃、酸櫻桃,為薔薇科落葉喬木植物果實,成熟期較早,有“早春第一果”之美譽。野櫻桃果實色澤艷麗,風味獨特,富含糖、蛋白質、維生素及鈣、鐵等多種元素,營養價值高;且川西野櫻桃在生長過程中幾乎不使用農藥,屬無公害果品[1],深受消費者喜愛。隨著對野櫻桃認知的深入,其市場需求量逐年增加。然而野櫻桃采摘周期短,果皮薄不耐運輸,并且貨架期和儲存期也遠低于市場上出現的蘋果、梨等水果,從而易造成大量鮮果堆積腐爛。將野櫻桃開發成具有高附加值的野櫻桃果酒,既可以最大程度保留野櫻桃的營養價值,又可以延長其貨架期,符合當前追求天然且有益于健康的飲酒潮流[2],具有廣闊的市場前景。

櫻桃果酒中香氣組成包括天然香氣、發酵香氣和陳釀香氣[3],大部分香氣物質多為果酒陳釀過程中形成的副產物,是構成和反映果酒生產工藝、果酒品質及典型性的主要因素。在果酒釀造過程中,陳釀時間長短對香氣成分及含量產生重要影響[4]。目前為止,酒的風味成分分離萃取技術包括靜態頂空法[5](Static headspace)、動態頂空法[6](Dynamic headspace)、固相微萃取[7](Solid-phase extraction)、以及液-液萃取(Liquid-liquid extraction)[8]等,其中固相微萃取技術憑借技術方便、成本低、靈敏度高且重現性好[9-10],廣泛運用于黃酒[11]、米酒[12]、堅果露酒[13]、葡萄酒[14]等各類酒的揮發性成分研究。

本研究以川西高原野櫻桃為原料,采用單因素和響應面分析法對其發酵工藝參數進行優化,以確定野櫻桃果酒的最佳工藝條件;并通過頂空固相微萃取(Headspace solid-phase microextraction HS-SPME)與氣相色譜-質譜聯用技術(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)對不同陳釀時間野櫻桃果酒中揮發性風味物質進行分析鑒定,對主要風味物質進行主成分分析,篩選出野櫻桃果酒特征風味成分,以期為川西高原藏區野櫻桃果酒生產過程提供可靠的科學依據,促進野櫻桃產業快速發展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮野櫻桃 川西藏區阿壩州小金縣;白砂糖(食品級) 市售;果膠酶(10000 U/g) 美國Sigma公司;果酒專用酵母 湖北安琪酵母股份有限公司;檸檬酸 天津市致遠化學試劑有限公司;氯化鈉(分析純)、K2S2O5(食品級) 天津市瑞金特化學品有限公司。

LPS-5離心式破碎機 旭郎機械成都分公司;DHP-9052電熱恒溫培養箱 上海益恒實驗儀器有限公司;WBL25C56榨汁機 美的(Midea)集團股份有限公司;氣相色譜-質譜聯用儀 日本島津公司;固相微萃取針頭 75 μm CAR/PDMS、手動進樣手柄 美國Supelco公司;酒精計 武強滏陽儀表廠;WYT-J型手持糖度計 成都光學廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 野櫻桃果酒釀造工藝流程

1.2.2 操作要點 原材料預處理:挑選新鮮成熟、無蟲害野櫻桃,清洗干凈、去核去皮。

榨汁打漿:將預處理好的野櫻桃榨汁打漿作為果酒發酵液。

酶解處理:果酒發酵液中添加質量分數0.3%的果膠酶,40 ℃恒溫攪拌維持2 h。

調配:添加適量SO2(K2S2O5),以抑制雜菌生長;添加適量白砂糖,調整野櫻桃果漿含糖量(原始含糖量為9 °Bx)。

酵母活化:取果酒專用干酵母,加入料液比1∶20的糖水,40 ℃活化30 min[3]。

發酵:將適量活化酵母接種至野櫻桃發酵液中,將貯酒罐放于培養箱中密封發酵15 d。

陳釀:將發酵后的酒樣轉入儲酒罐中進行陳釀,于15 ℃滿罐放置半個月,陳釀期間定期(10、12、14、16 d)觀察其揮發性成分的變化。

1.2.3 野櫻桃果酒發酵的單因素實驗 由于酒精度對果酒風味影響較大[15],故以酒精度為考察指標。固定果酒發酵初始糖度為18 °Bx、初始酵母接種量為5%、發酵溫度為25 ℃進行發酵,考察偏重亞硫酸鉀為(50、75、100、125 mg/L)對野櫻桃果酒發酵的影響;固定偏重亞硫酸鉀添加量為75 mg/L、初始酵母接種量5%、發酵溫度25 ℃進行發酵,考察初始糖度為(17、18、19、20 °Bx)對野櫻桃果酒發酵的影響;固定偏重亞硫酸鉀添加量為75 mg/L、初始糖度18 °Bx、發酵溫度25 ℃進行發酵,考察釀酒酵母接種量(1%、3%、5%、7%)對櫻桃果酒發酵的影響;固定偏重亞硫酸鉀添加量為75 mg/L、初始糖度18 °Bx、初始酵母接種量5%進行發酵,考察發酵溫度為(15、20、25、30 ℃)對櫻桃果酒發酵的影響。

1.2.4 響應面優化試驗 在單因素實驗結果基礎上,根據Box-Behnken響應面設計原理,選擇K2S2O5添加量、初始糖度、酵母接種量及發酵溫度等因素為考察變量,分別以A、B、C和D表示,并以-1、0、1表示變量水平,以酒精度(Y)為響應值進行優化,每組實驗重復3次。因素水平及編碼見表1。

表1 Box-Behnken設計實驗因素水平

1.3 指標測定

1.3.1 理化指標 糖度測定:手持折光儀法;酒精度測定:酒精計測定,以體積百分比計算[15];SO2測定:直接碘量法。

1.3.2 野櫻桃果酒風味成分分析

1.3.2.1 樣品前處理 取5 mL陳釀果酒于15 mL頂空萃取瓶,加入1.0 g NaCl[16],加蓋密封,于60 ℃水浴平衡30 min,將已老化的固相微萃取器插在樣品瓶上吸附40 min。萃取結束后,于氣相色譜儀220 ℃解吸5 min,進行GC-MS檢測分析[17]。

1.3.2.2 GC-MS檢測條件 氣相色譜條件:進樣口溫度250 ℃,升溫程序:起始溫度42 ℃保持2 min;以4 ℃/min升溫至82 ℃,保持2 min;以8 ℃/min升溫至130 ℃,保持2 min;以14 ℃/min升溫至200 ℃,保持7 min;以20 ℃/min升溫至240 ℃,保持10 min。載氣He,流量1.2 mL/min,分流比3∶1。

質譜條件:電子電離(electron ionization,EI)源,離子源溫度230 ℃,電子能量70 eV,接口溫度250 ℃,掃描范圍30.00～500.00 amu[18-19]。

揮發性風味物質經檢索,與NIST譜庫(107 k Compounds)及Wiley譜庫(320 k Compounds)匹配,并結合香精香料標準譜庫分析可能屬于野櫻桃果酒的風味物質,取匹配度不低于80%的組分;同時采用峰面積歸一化法計算各揮發性風味物質相對百分含量。

1.4 數據處理

實驗數據采用Design-Expert V 8.0.6、SPSS 22.0軟件進行分析,采用Origin 8.0、Excel 2010進行作圖,因子分析采用主成分分析法。

2 結果與分析

2.1 不同野櫻桃果酒發酵條件的對酒精度的影響

K2S2O5對果酒具有抑菌、抗氧化、護色、提高酒精度等作用。但過量添加會抑制酵母菌繁殖,導致發酵減慢,并使果酒具有明顯SO2刺激性氣味;添加不足,果醪易氧化,從而影響果酒成品風味[20]。由圖1a可知,K2S2O5添加量為75 mg/L時果酒酒精度為10.8%vol,因此選擇K2S2O5添加量75 mg/L。

圖1 不同因素對果酒酒精度的影響

適量糖度可為酵母發酵提供足夠能源,對發酵產酒精及芳香物質有重要影響。糖度過高會產生高滲透環境,從而抑制酵母菌生長[20],阻礙糖轉化為酒精;糖度過低會使酵母生長緩慢,導致發酵不能正常進行。由圖1b可知,隨初始糖度增加,果酒酒精度呈先增加后降低趨勢,初始糖度過高或過低,果酒發酵酒精度均不高。因此選擇發酵初始糖濃度19 °Bx。

酵母接種量對酒精發酵有重要作用。酵母接種量過低,會導致自身代謝生長遲緩,發酵不徹底[9];酵母接種量過高,會加快酵母自身新陳代謝,使轉化為酒精的糖分被大量消耗,同時伴隨著代謝物生成,酵母發酵環境質量降低,從而出現早衰和自溶,使得酒精度下降[21]。由圖1c可知,在野櫻桃果汁中加入5%的酵母,酒精度含量較高,因此選擇酵母接種量5%。

發酵溫度會直接影響酵母的生長繁殖,從而對酒精的生成以及風味物質的產生起重要作用[4]。由圖1d可知,在15～25 ℃發酵溫度條件下,果酒酒精度逐漸增加,當發酵溫度超過25 ℃時,酒精度呈現下降趨勢,可能由于溫度升高,酵母代謝速率加快,加速酵母進入衰亡期,從而影響酒精生成量以及糖轉化量[22]。因此選擇25 ℃為野櫻桃果酒發酵溫度。

2.2 野櫻桃果酒發酵工藝的優化

2.2.1 響應面試驗設計及結果 根據單因素實驗結果,選擇K2S2O5添加量(A)、初始糖度(B)、酵母接種量(C)和發酵溫度(D)為自變量進行Box-Behnken中心組合試驗設計,以酒精度為響應值,響應面試驗設計方案及結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計方案及結果

利用Design-Expert軟件對表2中響應值進行二次線性回歸擬合,得到二次多項式回歸方程預測模型為:

Y=10.84+0.22A-0.38B+0.66C-0.14D-0.32AC+0.025AD+0.25BC-0.1CD-0.17A2-1.05B2-1.76C2-0.56D2

2.2.2 方差分析 對上述二次回歸方程進行統計分析,結果見表3。

2.2.3 因素間交互作用分析 各因素對果酒酒精得率影響的響應面曲線如圖2。在Y模型中可知,AB、AD、BD、CD交互作用對響應值的影響不顯著,因此只對AC、BC的交互作用進行分析。響應面曲線陡峭程度可反映因素之間交互影響大小,坡度越陡,影響越大,且等高線形狀也可反映出各因素交互作用對響應值的影響,當等高線為橢圓時,說明交互作用顯著[23]。根據圖2可知,BC響應面曲線更為陡峭,其等高線形成橢圓且更為密集,表明酵母接種量和初始糖度交互作用對酒精度影響最為顯著,與方差分析結果一致。

2.2.4 工藝優化及驗證實驗 通過Design-Expert V 8.0.6分析得到野櫻桃果酒最優發酵條件:K2S2O5添加量80 mg/L,初始糖度19.4 °Bx,酵母接種量3.5%,發酵溫度23.3 ℃,在此條件下果酒酒精度為10.96%vol。為驗證模型可行性同時考慮實際操作性,設定最優發酵工藝參數:K2S2O5添加量80 mg/L,初始糖度19 °Bx,酵母接種量3.5%,發酵溫度23 ℃,以此條件重復3次實驗,得酒精度為10.8%vol。與理論預測值相差較小,表明該響應面回歸模型具有可行性。

2.3 不同陳釀時間野櫻桃果酒揮發性成分的分析比較

2.3.1 野櫻桃果酒香氣成分總離子流圖及成分統計 利用GC-MS對在最優發酵條件下,對不同陳釀時間(10、12、14、16 d)野櫻桃果酒揮發性物質進行檢測分析,其總離子流色譜圖如圖3所示,野櫻桃果酒香氣成分保留時間主要集中在7.5～32.5 min,通過NIST11譜庫檢索分析,共鑒定出90種揮發性風味物質。采用峰面積歸一化法可知鑒定出的化合物分別占總揮發成分總量的82.71%、93.80%、92.18%、91.02%。

2.3.2 主要揮發性風味物質分析 果酒香氣成分是評價果酒品質的重要指標之一[8],其種類豐富,主要包括酯類、醇類、酸類等[24]。醇類賦予果酒優雅的香氣[25],酯類賦予果酒濃郁的果香[26],對酒的主體香型有很大影響[27]。測定不同陳釀時間野櫻桃果酒中主要香氣成分及相對含量見表4。由表4可知,野櫻桃果酒中香氣物質主要有醇類(17種)、酯類(41種)、酸類(7種)、烴類(9種)、醛類(9種)。陳釀10 d野櫻桃果酒香氣成分共64種,醇類(占32.53%)相對含量最高,以7-十六-1-醇含量最高,其次為α-松油醇;陳釀12 d時果酒香氣成分種類及含量均有所增加,共74種,其中酯類含量相對最高(35.848%),醇類含量次之(35.48%);陳釀14 d,果酒香氣成分共有72種,醇類物質含量達到不同陳釀時間中最高,為38.36%,但酯類成分含量下降,僅為31.96%,不含有甲酸庚酯、乙酸己酯、乙酸芐酯、月桂酸甲酯以及10-十一烯酸乙酯等具有特殊香氣的物質;陳釀16 d,果酒香氣成分僅49種,且醇類和酯類物質含量最低,分別為30.29%、29.48%。

續表

根據肖作兵等[28]和張妮[29]的研究可知,苯甲醛、辛酸乙酯、己酸乙酯和乙酸己酯為櫻桃果酒最重要的香氣物質,其中苯甲醛[30]為櫻桃的主要香氣成分,使果酒具有特殊的苦杏仁味和焦糖味,由表4可知,苯甲醛隨陳釀時間延長,相對含量從4.04%增加到6.330%;而辛酸乙酯(2.26%)、己酸乙酯(3.46%)以及乙酸己酯(0.17%)均在陳釀12 d野櫻桃果酒中含量檢出最高。且經檢測發現,野櫻桃果酒經陳釀12 d時酒精度為10.1%vol,酒精度變化不大。綜合分析發現,野櫻桃果酒陳釀12 d時,在保持其原有酒精度的同時更有利于保留櫻桃清新的果香以及濃郁的酒香。

2.3.3 野櫻桃果酒主成分分析 使用SPSS 22.0分析軟件對不同陳釀時間野櫻桃果酒中共有揮發性物質進行主成分提取,以確定其關鍵香氣,最終結果見表5,主成分載荷矩陣見表6。由表5可知,共提出3個主成分,第一主成分貢獻率51.040%,第二主成分貢獻率29.129%,第三主成分貢獻率19.803%,累計貢獻率99.972%,因此,前3個主成分包含了41種共有揮發性風味物質絕大部分信息。

表5 提取3個主成分的方差解釋

表6 主成分載荷矩陣

由表6可知,對第一主成分貢獻較大的物質有兔耳醛、香葉醇、肉豆蔻酸、苯甲酸、正癸酸、(+)-2-蒈烯、正己酸、3-甲基芐醇;對第二主成分貢獻較大的物質有己酸乙酯、辛酸、γ-松油烯、丁香酚;對第三主成分貢獻較大的物質有9-十六碳烯酸乙酯、芳樟醇、順-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化-2-呋喃甲醇、壬酸、2,3,4-三甲基-3-戊醇、辛酸甲酯。整體野櫻桃果酒香氣物質主要為酯類、醇類和酸類,這與張妮[29]研究一致。

為了進一步明確第一主成分和第二主成分中各風味物質所起作用的差異,現以第一主成分載荷矩陣為橫坐標,第二主成分載荷矩陣為縱坐標作散點圖,見圖4。

圖4 共有揮發性風味物質的主成分分析

如圖4所示,根據各風味物質所處象限差異,第一主成分中8種風味物質對野櫻桃果酒風味影響主要分為2類,位于一、四象限內。第一類有兔耳醛、香葉醇、肉豆蔻酸、苯甲酸、(+)-2-蒈烯、3-甲基芐醇;第二類有正癸酸、正己酸。第二主成分中4種風味物質也對野櫻桃果酒風味的形成有影響作用,分別在一、二象限。第一類有己酸乙酯、γ-松油烯;第二類有辛酸、丁香酚。影響野櫻桃果酒香氣的主要成分位于第一主成分和第二主成分的正半軸處,即圖4中右上角圈內的物質,依次為苯甲醛、兔耳醛、鄰苯二甲酸丁基酯、油酸乙酯、苯甲酸、辛酸、肉豆蔻酸、2,3,4-三甲基-3-戊醇、順-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化-2-呋喃甲醇、芳樟醇、3-甲基芐醇、香葉醇、(+)-2-蒈烯、丁香酚、3,5-二叔丁基苯酚、棕櫚酸異丙酯,其中香氣貢獻較大的依次為辛酸、己酸乙酯、丁香酚、苯甲醛、油酸乙酯、芳樟醇,這些物質賦予了野櫻桃果酒特殊的果香、酒香、花香。

研究發現丁香酚、油酸乙酯及芳樟醇等為川西高原野櫻桃果酒中的特有風味物質。丁香酚有強烈的丁香氣息,具有抗菌、抗腫瘤、降血壓、促進吸收等多種藥理功能[31];油酸乙酯有花香和果香,黏性小且易被身體吸收,可作為類固醇等脂類藥物的優良溶劑以及內注射制劑的載體和微乳劑[32];芳樟醇有百合花和鈴蘭花氣息,具有抗菌、抗炎、鎮靜等作用[33],是金銀花發揮藥理作用的重要揮發性成分[34]。這些特有組分構成了川西高原野櫻桃果酒所獨有的風味特征,使其比普通櫻桃果酒具有更好的口感以及較好的營養保健功效。

3 結論

本研究通過單因素和Box-Behnken響應面試驗優化野櫻桃果酒,確定最佳發酵工藝條件為:K2S2O5添加量80 mg/L,初始糖度19 °Bx,酵母接種量3.5%,發酵溫度23 ℃,在此優化條件下,發酵15 d的野櫻桃果酒酒精度為10.8%vol;通過HS-SPME結合GC-MS對川西高原野櫻桃果酒中揮發性風味物質進行分析比較發現,陳釀12 d野櫻桃果酒中香氣成分種類更復雜,含量更豐富,其主要香氣成分為醇類(35.480%)和酯類(35.848%),如苯甲醛、甲酸庚酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、十三酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、油酸乙酯、正己酸、辛酸、芳樟醇和7-十六-1-醇。在這些香氣成分中,辛酸、己酸乙酯、丁香酚、苯甲醛、油酸乙酯和芳樟醇通過主成分分析表明對野櫻桃果酒香氣影響較大,且丁香酚、油酸乙酯和芳樟醇為野櫻桃果酒特有風味物質,對川西高原野櫻桃果酒的營養價值具有一定的營養保健功效。本研究為今后開發具有地域特色的川西高原野櫻桃發酵產品奠定科學基礎。