喘可治穴位注射治療慢性持續(xù)期支氣管哮喘的表觀遺傳學(xué)機(jī)制

周 晨，張 舒，王海濤，蔡 峰，范艷紅，許 靖，李 挺

（上海市第七人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 200137）

支氣管哮喘的特征在于對各種刺激敏感性發(fā)作和廣泛發(fā)作的氣道阻塞。在全球范圍內(nèi)，它影響著3億多各個年齡段的人。若不能較好的控制，哮喘會限制病人的日常生活，甚至導(dǎo)致死亡。支氣管哮喘是一種復(fù)雜的疾病，遺傳因素和環(huán)境因素均在哮喘的發(fā)展和表現(xiàn)中起作用[1]。目前國內(nèi)外研究認(rèn)為DNA甲基化的表觀遺傳變化可能導(dǎo)致哮喘的異質(zhì)性炎癥反應(yīng)[2]。推測目標(biāo)基因異常甲基化在哮喘的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。相關(guān)研究顯示支氣管哮喘病人的DNA甲基化及羥甲基化與哮喘的嚴(yán)重程度有關(guān)[3]。此外哮喘是無法治愈的，沒有一種治療方法能夠長期有效地治療炎癥或氣道重塑，只能通過控制癥狀暫時來改善，藥物是應(yīng)用于哮喘的一線治療方法。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明喘可治注射液具有消炎、平喘、止咳、免疫調(diào)節(jié)、增強(qiáng)應(yīng)激能力等作用，近年來逐漸應(yīng)用于改善呼吸癥狀和氣流受限，在減輕炎癥反應(yīng)和提高免疫功能方面療效顯著[4]。本研究旨在探討喘可治穴位注射治療慢性持續(xù)期支氣管哮喘病人是否對其表觀遺傳調(diào)控產(chǎn)生影響并獲得臨床療效，為探索其作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018-02～2019-02上海市第七人民醫(yī)院呼吸科支氣管哮喘慢性持續(xù)期病人共90例為研究對象，全部病人均符合支氣管哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。排除標(biāo)準(zhǔn):排除近30天合并肺部感染者，排除肺癌，氣管或喉癌病史的病人。隨機(jī)分為觀察組和對照組各45例。其中觀察組男25例，女20例，對照組男23例，女22例。觀察組年齡42～73歲，平均年齡61.5±9.7歲，對照組年齡40～75歲，平均年齡63.1±8.5歲，兩組病人的性別、年齡一般資料相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有可比性。

1.2 方法

對照組給予常規(guī)解痙平喘等西藥治療，觀察組在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用喘可治足三里穴位注射。每次穴位注射1支喘可治（2mL），每周2次，連續(xù)治療2個月。

穴位注射方法:注射前告知可能有輕微疼痛感。取2mL針筒，抽取1支喘可治，定位治療穴位，注射藥液。

1.3 評價標(biāo)準(zhǔn)

于治療前后分別評估兩組病人的哮喘控制測試評分（ACT）。采用肺功能檢測儀測定兩組治療前后第一秒用力呼氣量（FEV 1）、肺活量（FVC）及最高呼氣流速（PEF）。采用ELISA法檢測血清細(xì)胞因子干擾素-γ（IFN-γ）、白介素-4（IL-4）、白介素-17（IL-17）的含量。

外周血DNA甲基化及羥甲基化的測定:采用酚-氯仿法抽提外周血基因組DNA，并進(jìn)行亞硫酸鹽修飾，應(yīng)用甲基化DNA定量試劑盒測定DNA甲基化及羥甲基化。

2 結(jié)果

2.1 兩組病人治療前后ACT評分的比較

表1 兩組患者ACT評分的比較

2.2 兩組肺功能指標(biāo)的比較

表2 兩組肺功能指標(biāo)的比較

2.3 兩組病人治療前后5-mC和5-hmC活性的比較

表3 兩組5-mC和5-hmC的比較

2.4 兩組病人細(xì)胞因子的比較

表4 兩組患者細(xì)胞因子的比較

3 討論

哮喘是一種氣道慢性炎性疾病，哮喘最初可以發(fā)生在任何年齡[6，7]。全世界約有3億人受哮喘影響，每年約有1050萬的成年因哮喘而就醫(yī)[8]。了解哮喘的發(fā)作機(jī)制對于臨床診斷和治療至關(guān)重要[9]。在中醫(yī)中，哮喘屬于喘息綜合征和氣喘綜合征，關(guān)于這種疾病的記錄最早見于漢代（約公元200年），即《黃帝內(nèi)經(jīng)》，認(rèn)為而作喘咳痰則與肺、脾、腎三臟有關(guān)[10]。非急性期支氣管哮喘的治療以通絡(luò)、泄郁肅肺為主。此時采用針刺取穴，具有宣肺、解表的作用，本研究擬通過喘可治注射液穴位注射治療的方法探索其表觀遺傳學(xué)機(jī)制。

穴位注射療法是指將藥物（中草藥提取物，西藥，維生素，生理鹽水等）注射到某些穴位或特定部位。該療法的優(yōu)點(diǎn)是針刺刺激和藥物給藥同時完成。近年來一些系統(tǒng)評價表明，穴位注射療法可以預(yù)防術(shù)后腸梗阻，并能治療口灼癥[11]。同時，某些隨機(jī)對照試驗(yàn)表明，穴位注射無論是西藥還是中國中藥可改善癥狀哮喘病人，穴位注射（分別使用山莨菪堿和重組人干擾素γ）加上基本治療與基本治療相比能顯示改善哮喘控制的平均時間（-1.50天，95%CI，-2.36～-0.64；-2.48天，95%CI，-4.03～-0.93）[12]。且穴位注射組和對照組之間發(fā)生的不良事件無差異性顯著。穴位注射組的不良事件包括局部皮膚發(fā)紅，腫脹和疼痛，全部不良反應(yīng)均能迅速得到緩解，納入的隨機(jī)對照試驗(yàn)中未報(bào)告嚴(yán)重不良事件。足三里穴位健脾益氣化痰的功效，本研究采用足三里穴位注射喘可治，治療組病人的哮喘控制測試評分顯著升高。此外本研究將FEV1、FVC和PEF的水平作為肺功能的觀察指標(biāo)，提示喘可治穴位注射顯著改善非極性發(fā)作期哮喘病人的肺功能。

當(dāng)前的表觀遺傳學(xué)方法正在應(yīng)用于臨床前藥物開發(fā)，藥物與機(jī)體的遺傳機(jī)制正在建立聯(lián)系。Li和Ampleford等已證明遺傳多態(tài)性與哮喘和過敏癥的發(fā)生風(fēng)險相關(guān)[13]。5-mC和5-hmC是穩(wěn)定的表觀遺傳標(biāo)記，在哮喘早期發(fā)展和疾病發(fā)病機(jī)理中起著關(guān)鍵作用[14，15]。因此探討藥物治療哮喘的表觀遺傳調(diào)控的影響，能夠?yàn)樘剿髌渥饔脵C(jī)制和治療方向提供新思路。本研究測定了全基因組5-mC，5-hmC水平，喘可治注射液治療組病人的5-mC和5-hmC水平顯著低于對照組。提示喘可治穴注射治療法能降低機(jī)體的DNA甲基化和羥甲基化反應(yīng)。

已有研究證明DNA甲基化的表觀遺傳變化與T效應(yīng)細(xì)胞極化有關(guān)，靶向效應(yīng)細(xì)胞是解決哮喘的重要潛在機(jī)制。T H 2和T H 17途徑均涉及哮喘發(fā)作過程，該途徑中免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子特性對于維持呼吸道上皮的穩(wěn)定性是必不可少的。Vroman等等研究顯示輕度至中度哮喘病人中過敏原暴露或環(huán)境觸發(fā)會導(dǎo)致T H 2介導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞炎癥。樹突狀細(xì)胞（DCs）的激活狀態(tài)對于T H 2和T H 17細(xì)胞分化均至關(guān)重要。Liu等研究顯示了以TH2/TH17為主的哮喘病人中肺細(xì)胞灌洗液（BALF）中的IL-1β，IL-6，IL-23，補(bǔ)體C3a和血清淀粉樣蛋白A水平升高，且IL-1β與C3a水平相關(guān)。此外研究還發(fā)現(xiàn)了TH2/TH17型哮喘病人中IL-1β途徑起關(guān)鍵作用。哮喘病人肺細(xì)胞灌洗液（BALF）中的IL-1α，IL-6，IL-8，粒細(xì)胞集落刺激因子和GM-CSF水平也顯著升高。IL-1α直接參與IL-8的產(chǎn)生，并可能導(dǎo)致嗜中性哮喘。因此，Chairakaki等建議將TH2和TH17途徑作為潛在的治療哮喘的通路。本研究觀察哮喘病人在接受治療后DNA甲基化發(fā)生變化時，結(jié)果顯示喘可治能夠調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡和Th17型免疫反應(yīng)。

IFN-γ是巨噬細(xì)胞的強(qiáng)激活劑，其主要功能是保護(hù)宿主免受細(xì)胞內(nèi)感染，在機(jī)體感染機(jī)制中，IL-10通過抑制IFN-γ的表達(dá)使宿主清除病原體的能力下降，促進(jìn)炎癥的進(jìn)展。在宿主清除病原體，炎癥消除的過程中，IFN-γ水平上調(diào)。IL-4和IL-17也是涉及嚴(yán)重炎癥疾病的主要介體因子，能夠通過結(jié)合其受體誘導(dǎo)其他炎癥因子（如IL-1β、TNF-α、IL-4）的釋放。近年來研究顯示DNA甲基化表觀遺傳學(xué)異常參與哮喘的發(fā)生發(fā)展過程，推測其機(jī)制可能與DNA甲基化推進(jìn)哮喘發(fā)病基因表達(dá)增加，由炎癥因子介導(dǎo)的機(jī)體平衡被打破，從而造成哮喘病情的難以控制。本研究結(jié)果顯示觀察組在經(jīng)治療后IFN-γ水平顯著升高，IL-4和IL-17水平顯著降低，也進(jìn)一步提示機(jī)體DNA甲基化和羥甲基化等遺傳學(xué)的改變可能與調(diào)節(jié)炎癥免疫反應(yīng)密切相關(guān)。

綜上所述，喘可治穴位注射能顯著改善哮喘病人的哮喘控制癥狀和肺功能，推測其機(jī)制可能與調(diào)控機(jī)體DNA甲基化和羥甲基化，同時調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)有關(guān)。本研究為進(jìn)一步研究喘可治穴位注射治療哮喘的作用機(jī)制提供依據(jù)。