選擇性COX-2抑制劑聯合順鉑對肺癌新生血管的影響

魏 慧，張 卿

（1.內蒙古自治區人民醫院呼吸與危重癥醫學科，內蒙古 呼和浩特 010017；2.內蒙古醫科大學附屬醫院呼吸內科）

任何腫瘤的生長和轉移都依賴于血液供應[1]，腫瘤血供豐富，營養充分，導致腫瘤快速生長、惡化、轉移。血管新生依賴于促血管生長因子，目前促進血管新生的生長因子主要有bFGF、COX-2、TGF-β1等，它們能促進血管內皮細胞分裂增殖[2]，誘導腫瘤血管生成。肺癌是我國患病率最高的惡性腫瘤[3]，其中非小細胞肺癌最多見[4]，約75%～80%。

本研究前期實驗表明:COX-2在肺腺癌中高表達，并可促進肺癌細胞生長與增殖[5]。目前，國內外研究表明[6，7]，非甾體抗炎藥（NSAID）有抗腫瘤的作用，而且有協同傳統化療藥物發揮抗腫瘤作用。尤其選擇性COX-2抑制劑因其副作用小，已被應用于結腸癌、直腸腺癌的臨床實驗中[8]。

本研究旨在探討選擇性COX-2抑制劑聯合順鉑的抗腫瘤作用，為肺癌提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人肺癌細胞株A549，購買于中國醫學科學院腫瘤醫院腫瘤研究所。試驗動物:4周齡雌性BALB/C裸鼠32只，體重16～18g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司【試驗裸鼠許可證號SCXK（京2012-0001）】。

1.2 測量瘤重、對肺癌A549裸鼠移植瘤組織內血管生長因子測定

瘤重抑制率=（對照組移植瘤重-用藥組瘤重）/對照組瘤重×100%；免疫組化檢測腫瘤組織內bFGF、COX-2、TGF-β1血管生長因子。

1.3 結果判定

應用免疫組織化學和形態計量方法，用CD31標記微血管，置于顯微鏡下，計數采用微血管金標準法，COX-2陽性染色定位于胞質和胞膜染色，呈棕黃色著色，b-FGF、TGF-β陽性染色定位于胞漿/胞質染色，呈棕黃色彌漫著色。每個標本切4張片子進行染色，利用陽性細胞數評定。陽性細胞數評定法[9]:采用9分評分制，按照陽性細胞率和染色強度分別計分。

1.4 統計學處理

應用SPSS 20.0軟件進行統計分析。正態性檢驗采用單樣本K-S擬合優度法。計量資料以表示，兩樣本間比較采用t檢驗。多個樣本間不同時間點的數據比較采用重復測量資料的方差分析，計數資料以（n，%）表示，數據間比較采用χ2檢驗。P＜0 05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 成功構建肺癌A549裸鼠移植瘤模型

裸鼠荷瘤過程順利，生長狀態較好。移植瘤生長過程中，開始裸鼠背部皮下形成圓形、橢圓形、不規則形結節，觸摸偏硬，早期腫瘤呈灰白色，表面光滑，之后腫瘤逐漸增大。荷瘤后第8天開始用藥，裸鼠生長狀態良好。

2.2 NIM單獨以及聯合DDP對肺癌A549裸鼠移植瘤生長的影響

用藥治療后測量肺癌A549裸鼠移植瘤的瘤重變化，第22天處死裸鼠剝離移植瘤，計算腫瘤瘤重抑制率。NIM+DDP組分別與NIM組、DDP組比較，NIM+DDP組瘤重抑瘤率最強（P＜0.001），總體之間比較F值32.264（見表1）。

表1 用藥結束后各組裸鼠移植瘤瘤重和瘤重抑瘤率（）Tab.1 Tumor weight and tumor weight inhibition rate of transplanted nude mice in each group after treatment()

表1 用藥結束后各組裸鼠移植瘤瘤重和瘤重抑瘤率（）Tab.1 Tumor weight and tumor weight inhibition rate of transplanted nude mice in each group after treatment()

注：NIM組與DDP組比較，P＜0.001；NIM組與NIM+DDP組比較，P＜0.001；DDP組與NIM+DDP組比較，P＜0.001。

Group Normal control NIM DDP NIM+DDP Tumor weight（g）1.11±0.18 1.01±0.12 0.73±0.07 0.58±0.06 32.264＜0.001 inhibit rate of tumor weigh（%）9.91 34.23 47.75 F P

2.3 NIM單獨以及聯合DDP對肺癌A549裸鼠移植瘤細胞COX-2、bFGF、TGF-β1蛋白表達的影響

2.3.1 免疫組化測定COX-2在各組肺癌A549移植瘤中的表達COX-2陽性染色定位于胞質和胞膜染色，呈棕黃色著色，每個標本切4張片子進行染色，利用陽性細胞數評定。NIM+DDP組分別與對照組、NIM組、DDP組比較（P＜0.001），COX-2陽性表達呈對照組＞NIM組＞DDP組＞NIM+DDP組。總體之間比較χ2值為45.486（見表2，圖1）。

表2 COX-2在各組肺癌A549移植瘤中的表達Tab.2 Expression of COX-2 in lung cancer A549 transplanted tumor in each group

2.3.2 免疫組化測定b-FGF在各組肺癌移植瘤中的表達每個標本切4張片子進行染色，利用陽性細胞數評定。b-FGF在各組肺癌A549移植瘤中的陽性表達呈對照組＞NIM＞DDP＞NIM+DDP；而對照組與NIM組的陽性表達，（P＞0.05），無統計學意義。NIM+DDP與DDP組、對照組、NIM組的陽性表達（P＜0.001）。四組之間總體比較χ2值為44.238（見表3、圖2）。b-FGF陽性染色定位于胞漿/胞質染色，呈棕黃色彌漫著色。NIM+DDP組的陽性表達最弱（見圖2）。

表3 b-FGF在各組肺癌A549移植瘤中的表達Tab.3 Expression of b-FGF in lung cancer A549 transplanted tumor in each group

2.3.3 TGF-β免疫組化測定在各組肺癌移植瘤中的表達每個標本切4張片子進行染色，利用陽性細胞數評定。TGF-β在各組肺癌A549移植瘤中的陽性表達呈對照組＞NIM＞DDP＞NIM+DDP；而對照組與NIM組的陽性表達，（P＞0.05），無統計學意義。NIM+DDP與DDP組、對照組、NIM組的陽性表達（P＜0.001）。四組之間總體比較χ2值為42.715（見表4，圖3）。TGF-β陽性染色定位于胞漿/胞質染色，呈棕黃色彌漫著色。NIM+DDP組的陽性表達最弱（見圖3）。

表4 TGF-β在各組肺癌A549移植瘤中的表達Tab.4 TGF-expression in lung cancer A549 xenografts in each group

3 討論

腫瘤新生血管形成的一系列過程是在新生血管調節因子的嚴密調控下，使得腫瘤細胞自體分泌的生長因子然后作用于它自身的生長受體，從而形成自分泌循環，刺激新生血管的不斷增殖，促使腫瘤細胞無休止的生長與浸潤[10]。

本研究前期實驗表明:COX-2在肺腺癌中高表達，并可促進肺癌細胞生長與增殖[11]。另有研究表明，bFGF[12]，能直接誘導血管生成，腫瘤細胞產生的bFGF還可以引起TGF-β1表達上調，導致缺氧誘導因子減弱，且三者表達時微血管密度（microvessel density，MVD）顯著增加。COX-2是前列腺素合成過程中的限速酶[13]，正常生理狀態未見其表達，在血管生長因子分泌過多、癌基因刺激下，機體COX-2表達增強，并通過前列腺素、血栓素途徑，刺激血管生成增強，抑制內皮細胞凋亡。本實驗結果表明:尼美舒利對肺癌A549裸鼠移植瘤有抑制作用，尼美舒利與順鉑聯合對腫瘤生長的抑制作用更強，推測，尼美舒利有協同順鉑起到抑制肺腫瘤的生長的作用。

本實驗免疫組化結果顯示，COX-2在尼美舒利組與對照組的陽性表達有明顯差異（P＜0.05），肺癌中COX-2的表達可被選擇性COX-2抑制劑尼美舒利所抑制。我們免疫組化結果還表明，尼美舒利順鉑聯合組COX-2的表達分別與尼美舒利組、順鉑組、對照組比較，有顯著差異（P＜0.05），有統計學意義。我們前期體外實驗研究也得出相同的結果。國外研究表明:在卵巢癌研究中[14]，發現選擇性COX-2抑制劑可顯著增強腫瘤細胞對順鉑誘導凋亡的敏感性，二者聯合時明顯降低卵巢癌細胞株的增殖，降低順鉑的用量。

bFGF[15]能直接誘導血管生成。TGF家族是一類結構、功能相關的多肽生長因子，TGF-β1是其家族成員之一，它的作用是促進VEGF以及bFGF的形成，從而影響腫瘤細胞的增殖、分化[16]。

本研究免疫組化結果顯示:肺癌A549裸鼠移植瘤細胞均有b-FGF、TGF-β1陽性表達，兩個因子陽性染色均位于胞漿，呈棕黃色彌漫著色，表明尼美舒利單獨使用對b-FGF、TGF-β1的下調作用不明顯，當與順鉑聯合作用于肺癌A549裸鼠移植瘤時，明顯抑制b-FGF、TGF-β1的表達，且抑制效果好于尼美舒利組以及順鉑單藥組。有研究表明[17]:選擇性COX-2抑制劑通過下調膽道腫瘤細胞VEGF、b-FGF的蛋白表達起到抑制膽道腫瘤生長的作用。在非小細胞肺癌及其周圍基質細胞中，COX-2、TGF-β1蛋白表達均增加，且瘤內微血管密度增加，選擇性COX-2抑制劑通過抑制COX-2的表達下調TGF-β1的蛋白表達，減少微血管的產生，進而抑制肺癌細胞的增殖與生長[18]。

綜上所述，選擇性COX-2抑制劑有抑制腫瘤生長作用，聯合化療藥物可增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，即增強順鉑對肺癌的細胞毒作用，從而更好地發揮抗腫瘤效應，在肺癌的治療中有重要意義，為肺癌的綜合治療提供了新的方案。

4 結論

選擇性COX-2抑制劑聯合順鉑對肺癌的生長有抑制作用，抑瘤率明顯高于順鉑單藥組;選擇性COX-2抑制劑增強順鉑對肺癌的抑瘤作用，可能通過下調肺癌新生血管因子COX-2、bFGF、TGF-β1的蛋白表達，進而抑制肺癌血管新生，達到協同抗腫瘤的作用。選擇性COX-2抑制劑聯合順鉑將有可能為肺癌綜合治療提供新思路。