芽孢桿菌制劑對雞腸道腸球菌的影響和評價

陳 彬，郝思軍，朱 超

（1.寶應(yīng)縣畜牧獸醫(yī)站，江蘇 揚州 225800；2.寶應(yīng)縣曹甸鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，江蘇 揚州 225803）

本次實驗選取日齡相同，體重大小相近的新?lián)P州雞（公雞）共21只，按體重配對隨機分為3組，一組對照組，一組實驗1組，一組實驗2組，每組7只即每組7個重復(fù)，采用改進的強飼法來研究基礎(chǔ)日糧中添加一種新開發(fā)的活菌制劑（芽孢桿菌制劑）對雞盲腸、直腸的影響。通過實驗結(jié)果表明，在日糧中添加0.4%的該活菌制劑可以顯著促進某些腸球菌的生長。

1 活菌制劑的微生物種類及主要特性

選作活菌制劑的微生物種類主要有酵母類微生物、乳酸桿菌屬、芽孢桿菌屬等，這些主要從土壤、發(fā)酵食品、腌制品、動物消化道、動物糞便的無毒菌株中提取。目前，首選的是乳酸菌，芽孢桿菌次之。

乳酸桿菌屬為厭氧或兼性厭氧菌，主要分泌乳酸及短鏈脂肪酸，能降低腸道中的pH值，抑制有害菌的生長。但是，該類菌較不穩(wěn)定，不能耐受飼料加工和長期存放；酵母類是飼料中應(yīng)用最早、最廣泛的飼用微生物，主要是為動物提供蛋白質(zhì)，幫助消化，提高機體的代謝力；芽孢桿菌屬的菌為需氧菌，它在無氧條件下不繁殖，它通過競爭奪氧來抑制有害菌和外來菌的生長、繁殖，從而維持動物消化道的微生態(tài)平衡等。因此，近年來對芽孢桿菌屬的制劑研究增多。

1.1 芽孢桿菌的特點

芽孢桿菌是目前常用的一類活菌制劑，作為微生態(tài)制劑，有人稱其為超乳酸菌。芽孢桿菌是一類好氧或兼性需氧生長、可形成芽孢的革蘭氏陽性菌，在制劑中以內(nèi)生孢子形式存在。在制備過程中，其孢子具有耐高溫、耐酸堿、耐擠壓的特性，且在飼料加工制備過程中損傷性小。芽孢桿菌對外界環(huán)境的抵抗力比較強，可耐高溫在60℃以上，在常溫情況下可以保存一年以上，易培養(yǎng)和加工成各種制劑，而且效果相對穩(wěn)定。芽孢桿菌制劑作為活菌制劑，芽孢孢子進入動物的腸道后，在動物腸道上部休眠的孢子將迅速復(fù)活發(fā)芽、生長成為有新陳代謝作用的營養(yǎng)型細胞，分泌活性很強的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶，利于降解飼料中某些復(fù)雜化合物，飼料的利用率也能夠得到有效提升；還可以產(chǎn)生具有拮抗腸道致病菌的多肽類物質(zhì)，同時通過生物奪氧消耗腸道內(nèi)的氧氣，形成厭氧環(huán)境。腸道原籍優(yōu)勢菌多屬于厭氧菌，而消化道中的有害菌多為需氧菌，使用芽孢桿菌可以維持腸道的生態(tài)平衡。

1.2 腸球菌臨床的重要性

腸球菌在自然界中的分布比較廣泛，也是人和畜禽動物胃腸道的正常菌群之一。在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌約占80%～90%，屎腸球菌約占5%～15%，鶉雞腸球菌、鉛黃腸球菌、堅忍腸球菌、鳥腸球菌和棉子糖腸球菌約占5%以下。近年來，一些少見的菌種所致的感染時有報道，如盲腸腸球菌腹膜炎、膽囊炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、尿路感染及腎盂腎炎等多種感染。出現(xiàn)這些情況的主要原因是腸球菌對現(xiàn)有的一些抗生素耐藥性在逐年增加，甚至出現(xiàn)了萬古霉素耐藥腸球菌的相關(guān)案例，張正等對兩年間分離于院內(nèi)感染標(biāo)本的553株腸球菌進行了耐藥分析，其中91.9%的為糞腸球菌，對萬古霉素的耐藥率分別為2.95%、對替考拉寧的耐藥率分別為0.83%，其中VanA6株、VanB9株、VanC3株有VRE的出現(xiàn)，導(dǎo)致很難控制該菌在患者之間的傳播。感染控制措施要依靠隔離和控制VRE定植或感染的病人。盡管VRE定植的方式尚不清楚，但采取有效的方法快速鑒定病人定植或感染VRE是非常必要的[1]。

本次試驗采用選擇性培養(yǎng)基對雞體內(nèi)腸球菌在盲腸、直腸的分布進行了測定，為以后微生態(tài)制劑研究在腸段選擇，菌種選擇方面做基礎(chǔ)，為微生態(tài)制劑的研發(fā)工作提供參考和幫助。

2 試驗及分析

2.1 材料與方法

2.1.1 實驗動物：選購揚大農(nóng)牧場內(nèi)120日齡種公雞21只，均臨床健康。

2.1.2 實驗制劑：活菌制劑（由張艷云老師提供）；雞場自配基礎(chǔ)日糧；腸球菌從雞腸道分離。

2.1.3 培養(yǎng)基：腸球菌培養(yǎng)基（疊氮鈉--結(jié)晶紫--七葉苷瓊脂）：用于選擇培養(yǎng)腸球菌；購于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

2.1.4 實驗儀器：電熱恒溫培養(yǎng)箱；電熱鼓風(fēng)干燥箱；高壓滅菌鍋；微凈化操作臺；推棒；酒精燈；三角燒瓶；試管；恒溫水浴震蕩器。

2.2 方法

2.2.1 實驗分組：將21只雞分為3組，每組為7只。實驗1組中的7只雞，在飼喂的食料中添加了0.2%微生態(tài)活菌制劑；實驗2組中的7只雞，在飼喂的食料中添加了0.4%微生態(tài)活菌制劑；實驗3組中的7只雞，飼喂基礎(chǔ)的日糧作為對照組。

2.2.2 實驗雞準(zhǔn)備：預(yù)試期：將3組雞在同一環(huán)境條件下飼喂基礎(chǔ)日糧，每日觀察雞群的精神狀態(tài)、采食及排便情況，進行飼喂一周以后，21只雞的健康狀況均良好。正試期：3組雞分開飼喂，每天喂給實驗組1的雞150g拌有活菌制劑0.2%的飼料；每天喂給實驗組2的雞150g拌有活菌制劑0.4%的飼料；喂給對照組雞150g基礎(chǔ)日糧，3組雞均在同一環(huán)境條件下飼喂。

2.2.3 取材與處理：選好試驗用的雞后送到實驗室進行剖殺，先用75%的酒精對皮毛消毒后再進行無菌手術(shù)。將盲腸和直腸取出后，段成小段后放入滅菌平皿中，取3g內(nèi)容物放在滅菌三角燒瓶內(nèi)，加入27ml生理鹽水稀釋液在37℃恒溫水浴震蕩器中，振蕩30分鐘以后形成均勻的懸濁液，再以10倍稀釋法依次稀釋為10-1、10-2……10-9。

2.2.4 接種與培養(yǎng)：取稀釋好的腸內(nèi)容物100ul，分別從低稀釋度至高稀釋度接種，每個稀釋度接種3個平皿，要快速準(zhǔn)確的完成操作步驟，操作完成后立即將腸球菌放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)時間為24h。

2.2.5 計數(shù)及數(shù)據(jù)統(tǒng)計：采用活菌計數(shù)法，每克糞便中的活菌數(shù)對數(shù)值log10nCFU/g=log（稀釋倍數(shù)×3個平皿菌落均值）。所以數(shù)據(jù)均采用Excel統(tǒng)計工具進行統(tǒng)計分析，顯著性檢驗采用SPSS法進行檢驗。

2.3 結(jié)果與分析

微生態(tài)制劑飼喂實驗結(jié)果見表1（單位：logCFU/g）

3 討論

乳酸菌作為健康的腸道細菌之一，對人體是安全的。由于乳酸菌大量定植在腸道中，會影響到腸道的消化吸收及其他功能。由于現(xiàn)在對廣譜抗生素、免疫抑制劑等的使用較多，以及艾滋病、肝炎、腫瘤等疾病的出現(xiàn)導(dǎo)致機體免疫力下降，造成受感染幾率增加。

腸球菌屬自1984年獨立新屬來至今已有19個菌種，其中糞腸球菌更易成為條件致病菌。腸球菌是重要的乳酸產(chǎn)生菌，能調(diào)節(jié)脂代謝，具有微生態(tài)學(xué)的意義，已經(jīng)應(yīng)用于保健品及臨床如一些酸奶、飲料、藥品等。屎腸球菌與不溶血腸球菌可能更適合作為微生態(tài)調(diào)節(jié)劑。

隨著我國畜禽業(yè)的不斷發(fā)展，對畜禽健康生長的產(chǎn)品研究探尋也在進行中。中國加入WTO后，綠色健康的農(nóng)產(chǎn)品面臨著一定的壓力，越來越多的學(xué)者提倡對微生態(tài)制劑的開發(fā)和應(yīng)用。根據(jù)微生態(tài)學(xué)原理，采用微生態(tài)制劑和微生態(tài)工程技術(shù)能夠重建畜禽腸道的正常微生物菌群，預(yù)防和治療畜禽養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的腸胃疾病問題，減少使用抗生素，提升飼料轉(zhuǎn)化率，減少畜禽養(yǎng)殖的生產(chǎn)成本。而且，在畜禽飼養(yǎng)中使用微生態(tài)制劑可確保畜禽產(chǎn)品無毒、無害、無殘留和無污染。同時，能夠減少畜禽糞便產(chǎn)生的氣味，從而保護環(huán)境，可見微生態(tài)制劑的開發(fā)和研究的前景廣闊。