山羊痘病毒檢測方法分析

王李輝，劉澤華

（1.平頂山市動物疫病預(yù)防控制中心，河南 平頂山 467000；2.寶豐縣動物疫病預(yù)防控制中心，河南 寶豐 467400）

1 山羊痘病毒的簡要概述

山羊痘由山羊痘病毒引起的，是一種急性、熱性接觸性傳染病。其特征為皮膚和可視黏膜出現(xiàn)丘疹和皰疹[1]。山羊痘病毒多發(fā)于細毛羊、山羊、綿羊與羔羊之間，其容易引起包括印度羊皮炎與肯尼亞綿羊痘在內(nèi)的諸多其他惡性痘病。感染山羊痘病毒的病羊，通常會出現(xiàn)高燒發(fā)熱，體溫在短時間內(nèi)可迅速升高至40℃至42℃，食欲減退、體型消瘦的癥狀。部分病羊還會出現(xiàn)皮膚水腫與淋巴結(jié)腫大的癥狀，感染該病毒的母羊則會出現(xiàn)產(chǎn)乳量驟減的情況。還有部分病羊在感染山羊痘病毒后會出現(xiàn)無毛的臨床表現(xiàn)，其不僅對山羊生長發(fā)育與生產(chǎn)性能造成不利影響，同時也極大影響了羊毛與羊皮制品的品質(zhì)。根據(jù)相關(guān)研究數(shù)據(jù)顯示，成年羊感染該病毒后的死亡率超過42%，羔羊感染該病毒后致死率更高，幾乎達到100%。

2 山羊痘病毒的常用檢測方法

2.1 病原學(xué)檢測方法

隨著近些年國內(nèi)外研究人員逐漸加大了對山羊痘病毒及其檢測的研究力度，目前在檢測該病毒中已經(jīng)出現(xiàn)了許多具有一定準(zhǔn)確度和可操作性的檢測方法。其中之一即為病原學(xué)檢測法，例如可通過對感染該病毒的病羊皮膚組織進行采集提取，或是可選擇將病羊鼻腔分泌物、高燒發(fā)熱期間內(nèi)的血液、出現(xiàn)腫大情況的淋巴結(jié)作為病料進行采集，而后進行病毒分離與電鏡觀察即可進行準(zhǔn)確檢測。例如有研究人員通過選擇疑似感染山羊痘病毒的病羊皮膚皰疹以及水疤作為病料進行采集，而后接種BHK-21傳代細胞盲傳3代。通過使用電子顯微鏡進行認真觀察后，可明顯發(fā)現(xiàn)其出現(xiàn)細胞病變，且其存在一定規(guī)律性。而后使用這一BHK-21細胞培養(yǎng)物對日齡為9d的雞胚絨毛尿囊膜進行接種，當(dāng)傳代次數(shù)越來越多時，發(fā)現(xiàn)痘斑病變出現(xiàn)也愈發(fā)頻繁。在電鏡觀察中，研究人員通過分別使用硝酸鉛、醋酸鉛對培養(yǎng)得到的材料切片進行雙重染色，而后認真觀察病毒粒子，可發(fā)現(xiàn)其初期呈現(xiàn)為大小在250nm至350nm之間的卵圓形，被膜內(nèi)含有較高電子密度，均勻物質(zhì)在被膜內(nèi)的占比相對較大。中后期病毒粒子直徑明顯減小，且存在較高致密性，此時電子密度呈不均勻性，通過觀察可將病毒粒子中央有核酸芯髓，其呈現(xiàn)出類似啞鈴的形狀，同時還有兩個側(cè)小體。

2.2 血清學(xué)檢測方法

血清學(xué)檢測法也是當(dāng)前在山羊痘病毒檢測中常用的一種方法，按照具體類型，可將該方法細分成病毒中和與免疫瓊脂擴散試驗、酶聯(lián)免疫吸附與免疫熒光抗體試驗等等。例如在早期使用免疫瓊脂擴散試驗法進行檢測時，有研究人員通過先反復(fù)3次凍融盲傳4代后感染BHK-21細胞培養(yǎng)物，而后將其連同山羊痘標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，一起進行免疫瓊脂擴散試驗，發(fā)現(xiàn)有白色沉淀線出現(xiàn)。對比正常細胞沉淀抗原以及PBS可知，其不存在沉淀線，故而有效達到檢測山羊痘病毒的效果。但后期檢測人員也發(fā)現(xiàn)，在使用該檢測法時，如果選取感染山羊痘病毒的病羊皮膚黏膜痘疹以及感染細胞培養(yǎng)物作為病料，則病料中含有較多病毒粒子的，其陽性檢出率反而相對較低。因此在使用血清學(xué)相關(guān)理論與原理下，檢測人員開始逐步將免疫熒光抗體試驗、血凝試驗等應(yīng)用在山羊痘病毒檢測中，并獲得了良好的檢測效果。如通過使用專門的熒光抗體檢測設(shè)備，當(dāng)采集病羊痘皮膚痘疹作為病料并將其制作成切片，與感染細胞抹平一起進行免疫熒光抗體試驗時，利用該檢測設(shè)備，若發(fā)現(xiàn)存在明顯的特異性熒光，且熒光顏色呈黃綠色，即代表患病羊確實感染山羊痘病毒。

3 分子生物學(xué)檢測

在山羊痘病毒檢測中另一種常用檢測方法即為分子生物學(xué)檢測法，其主要包括PCR檢測法、熒光定量PCR檢測法等等。以PCR檢測法為例，該檢測法中PCR指的就是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，主要利用體外酶促進合成特異性DAN。使用該種檢測方法可以在短時間內(nèi)使目的DNA得到有效擴增，對于分離和克隆基因等具有一定優(yōu)勢效用。由于山羊痘病毒從本質(zhì)上看，屬于一種雙股DNA病毒，因此有研究人員通過對山羊痘病毒DNA進行提取，并依照其P32基因?qū)σ镞M行合理設(shè)計，發(fā)現(xiàn)使用PCR檢測法能夠快速、準(zhǔn)確地檢測出山羊痘病毒株，對于山羊痘疹樣本當(dāng)中的山羊痘病毒DNA也同樣具有較高的檢出率。在該檢測技術(shù)的進一步發(fā)展下，出現(xiàn)了多重PCR檢測法，可一次性對多種疾病進行有效檢測。例如有研究人員針對綿羊痘與山羊痘病毒的基因組序列，分別設(shè)計兩對引物，每一對引物均具有較高特異性。在進行條件優(yōu)化后，建立起相應(yīng)的雙重PCR檢測法，可同時快速、精準(zhǔn)地完成山羊痘與綿羊痘病毒檢測。

4 結(jié)語

總之，目前在山羊痘病毒檢測中，檢測方法技術(shù)多種多樣，包括建立在病原學(xué)、血清學(xué)以及生物分子學(xué)基礎(chǔ)上的檢測方法。其對于檢測山羊痘病毒均具有一定的應(yīng)用優(yōu)勢，未來相關(guān)工作人員還需繼續(xù)加強對山羊痘病毒檢測技術(shù)的深入探究，探索更多高效、靈敏度與準(zhǔn)確度更高、操作便捷、成本低廉的檢測技術(shù)，以此獲得更理想的檢測效果。