菊米提取物對糖尿病視網膜病變大鼠CTGF表達的影響

陳韶奇 張志梅 卿莉萍 劉歡漾 龍昱

摘? ? 要：為探討菊米提取物對糖尿病視網膜病變大鼠CTGF表達的影響。將雄性SD大鼠40只隨機分為3個試驗組和對照組，每組10只。實驗組應用鏈脲佐菌素注射建立糖尿病視網膜病變大鼠模型，再隨機分為A組糖尿病無治療組、B組菊米提取物給藥組、C組羥苯磺酸鈣給藥組。正常對照組為D組，注射同等劑量枸櫞酸鹽溶液。造模后1周，B、C組大鼠每天分別給予菊米提取物、羥苯磺酸鈣經口灌胃治療，A、D組大鼠每天給予等量生理鹽水灌胃;第4，8，12周時分別監(jiān)測大鼠體重和血糖;12周后，處死大鼠，摘取眼球，剝離其視網膜組織做石蠟切片并HE染色;采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測視網膜CTGF的表達。結果表明菊米提取物一定程度上可以降低DR大鼠模型的血糖水平和控制其體重，減少視網膜神經節(jié)細胞的溶解和細胞水腫，緩解視網膜內顆粒層厚度減少的情況，降低DR大鼠CTGF濃度水平。菊米提取物可以調節(jié)DR大鼠模型血糖水平和控制其體重，改善大鼠視網膜變薄狀態(tài)，一定程度上減少DR大鼠視網膜組織損傷程度，抑制DR大鼠CTGF表達，對延緩糖尿病大鼠視網膜微血管纖維化的進程有一定抑制作用。

關鍵詞：菊米提取物;糖尿病視網膜病變;CTGF

中圖分類號：R285; R-332? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.09.005

Abstract： To investigate the effect of Jumi extraction on the expression of CTGF in diabetic retinopathy rats，forty males SD rats were randomly divided into three experimental group and a control group，ten rats in each group. The experimental group application chain urea with cephalosporins injection to establish the rat model with diabetic retinopathy， and then randomly divided into a diabetes group（group A）， a chrysanthemum extract group （group B）， and a calcium dobesilate group （group C）.The control group was named group D， injected with the same dose of citrate solution. After modeling for 1 wk， the rats in group B and C were given Jumi extraction and Doxium tablets by oral gavage very day， and the rats in group A and D were given the same dose of normal saline every day. At the 4th， 8th， and 12th weeks， the weight and blood glucose of the rats were monitored respectively; after 12 weeks， the rats were killed， the eyeballs were removed， and the retinal tissues were peeled off for paraffin sections and HE stained; the expression of CTGF in the retina was detected by enzyme-linked immunosorbent assay （Elisa）.The results showed that Jumi extract coula reduce the blood sugar level of diabetic retinopathy rats and control its weight to a certain extent， reduce the dissolution and cell edema of retinal ganglion cells，alleviate the decrease in the thickness of the granular layer in the retina， and reduce the diabetic retinopathy rats Concentration level of CTGF / Total protein. Jumi extract could regulate the blood sugar level and control the weight of rats with diabetic retinopathy， improve the thinning of the retina of rats， reduce the degree of damage to the retinal tissue of rats with diabetic retinopathy， and inhibit the expression of CTGF. It has a certain inhibitory effect in delaying the process of retinal microvascular fibrosis in diabetic rats.

Key words： Jumi extraction; diabetic retinopathy; CTGF

作為一種嚴重危害人類健康的慢性全身性代謝性疾病，糖尿病 （Diabetes Mellitus，DM）常并發(fā)心血管動脈粥樣硬化疾病、神經系統(tǒng)疾病、糖尿病足和微血管病變等，糖尿病視網膜病變（Diabetic retinopathy， DR）是DM微血管病變中最為常見和嚴重的眼部并發(fā)癥之一[1]。近年來，由于DM趨于年輕化，其防治、研究尤顯重要。

菊米為菊科草本植物，性寒味甘，經由野菊篩選、人工栽培種植，采摘菊花蕾加工而成。臨床研究發(fā)現以菊花為有效成分的益氣清肝活血湯對高血壓性視網膜病變患者進行治療，能緩解眼底視網膜的出血及水腫，改善視力。作為其加工產物的菊米含有豐富的揮發(fā)油、菊米內酯、多糖、黃酮等生物活性物質，能清火明目、潤肺敗毒、平肝降壓、控血壓及降血脂等[2-3]，對皮膚、癌癥、心血管、視網膜等臨床疾病也有著良好的治療作用，但其作用機制尚不明確。結締組織生長因子（connective tissue growth factor， CTGF）為新發(fā)現的一種富含半胱氨酸的具有致纖維化作用的多肽蛋白，被認為是最具特異性的促纖維化因子之一，其在一定條件下能誘發(fā)肝、肺、腎纖維化及血管纖維化[4-7]，參與調控視網膜纖維化過程[8]，在DR患者的視網膜增殖過程中起著主導地位，并有望成為DR防治的潛在靶點[9]。雖然CTGF與DR的關系已逐漸受到關注，但關于兩者的研究較少。本研究通過建立經典DM大鼠模型，觀察菊米提取物對DR大鼠血糖、體質量及視網膜病變的影響，分析DR大鼠視網膜中CTGF表達水平的變化，探討菊米提取物對DR的可能作用機制，為臨床上改善和治療DR提供研究資料。

1 材料和方法

1.1 試驗動物及分組

選擇二級健康SD大鼠40只，2月齡，均為雄性，體質量250±10 g，由長沙醫(yī)學院動物實驗中心購入，編號：SYXK湘2017-0003，SPF級環(huán)境飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為（22±2） ℃、相對濕度45%～65%經裂隙燈及直接檢眼鏡檢查屈光間質清，眼底無異常者納入實驗。定量給食，晝夜自然變化。將所有大鼠適應性喂養(yǎng)1周，禁食水12 h后，隨機分為4組：A組（糖尿病組）、B組（菊米提取物組），C組（羥苯磺酸鈣組），D組（空白對照組）。

1.2 試驗試劑和器材

菊米（購自浙江省嘉興市，生產許可證批號：SC11433048301049，產品標準號：GB/T18862），檸檬酸，檸檬酸三鈉，2%鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）（ 購于上海偉進生物科技有限公司，批號：S0130-500MG），羥苯磺酸鈣（購于貴州天安藥業(yè)股份有限公司，國藥準字H20010795），CTGF酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（ m1002995-2，購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司），4%水合氯醛，高糖高脂飼料。熒光分光光度計，光學顯微鏡，低溫高速離心機，血糖儀，全自動生化分析儀等。

菊米提取物制備：將菊米干燥粉碎，過60目篩，600 g菊米用10倍量純水提取2次，提取液濃縮至120 mL，配成含生藥量5 g·mL-1溶液備用[3]。

2%鏈脲佐菌素制備：稱取-20 ℃保存的100 mg STZ，迅速加入配好的5 mL、0.1 mol·L-1檸檬酸緩沖液（稱取檸檬酸1.082 g、檸檬酸三鈉1.426 g，倒入100 mL燒杯，加入90 mL H2O，攪拌溶解，調節(jié)pH值=4.5，定容至100 mL，貯于4 ℃冰箱中備用），注意避光，現用現配。

0.1 mol·L-1檸檬酸緩沖液：稱取檸檬酸1.082 g、檸檬酸三鈉1.426 g，倒入燒杯，加入90 mL H2O，攪拌溶解，調節(jié)pH值=4.5，定容至100 mL，貯于4 ℃冰箱中備用。

1.3 DR動物模型造建及給藥

1.3.1 造模 A、B、C組均接受2%鏈脲佐菌素（60 mg·kg-1） 腹腔注射，同時結合高糖高脂飼養(yǎng)建立糖尿病模型，D組大鼠注射同樣體積的枸櫞酸鹽溶液，正常喂養(yǎng)，自由飲水。72 h后在大鼠尾靜脈采血，用血糖儀檢測血糖濃度，凡空腹血糖濃度≥16.7 mmol·L-1，尿糖>+++，尿量及飲水量均明顯增多者視為造模成功[10]。每隔2周測1次血糖及體質量（在試驗進程中，當大鼠的血糖>28 mmol·L-1時，用精蛋白重組人胰島素注射液3-4U皮下注射，以降低死亡率）。

1.3.2 給藥 造模1周后，A組和D組給予1 mL 0.9%生理鹽水灌胃、B組和C組分別以同等劑量的菊米提取物、羥苯磺酸鈣灌胃;均為1天1次，灌胃12周。給藥4周、8周和12周后分別測定各組大鼠體重，尾靜脈采血，測定血糖濃度。

1.4 組織學觀察

給藥12周后的大鼠腹腔注射4%水合氯醛0.5 mL·（100 g）-1，麻醉后，快速摘除大鼠雙側眼球，于顯微鏡下剝離視網膜，左眼球視網膜制成勻漿待用;右眼球視網膜固定后進行石蠟包埋、切片、脫蠟、蘇木素伊紅（HE）染色、脫水、透明。

每只右眼選擇4張切片，每張切片隨機選取視網膜3個視野，4張切片測量平均值作為1個樣本。采用計算機圖像分析系統(tǒng)觀察視網膜組織結構變化，注意觀察視網膜神經節(jié)細胞變化，并通過Image J軟件測量視網膜內顆粒層厚度，以此判斷DM大鼠視網膜損傷情況。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附法檢測視網膜CTGF的表達

取視網膜組織勻漿，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法，按照ELISA試劑盒操作步驟，測定不同濃度CTGF標準品溶液的OD值，繪制標準曲線，得線性方程回歸y=0.000 6x + 0.0736，R2=0.998 5，再測定樣本的OD值，依據回歸方程計算樣本濃度，計算各組大鼠視網膜內CTGF的濃度，并測出各組CTGF/Total protein比值變化。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對實驗數據進行處理分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，計量資料進行正態(tài)性檢驗后進行方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 SD大鼠臨床表征觀察

試驗結束時，D組（空白對照組）大鼠全部存活， 一般情況良好，攝食飲水正常，精神狀況好，體質量平穩(wěn)增長，二便正常，無死亡;A組有1只大鼠自尾靜脈采血后，斷尾處傷口紅腫潰爛，于造模后第38天死亡;有一只大鼠造模9周后眼底開始變渾濁，到取材之日眼球可見白色渾濁物;剩余大鼠較其他組明顯消瘦，精神萎靡，反應遲鈍，毛色枯槁，尾部紫紅，有數個大鼠頭頸部皮肉分離;B、C組的大鼠與D組比較，攝食飲水量多，體質量稍有減輕，精神狀況較A組表現好。

2.2 血糖和體質量變化

給藥4周、8周和12周后分別測定4組大鼠血糖、體質量，具體結果見表1、表2。 4、8、12周時，A、B、C三組大鼠血糖水平均明顯高于D組，比較差異極顯著（P< 0.05）;同時A、B、C三組大鼠的體質量均較D組有所降低（P<0.05）。且B組大鼠體質量均較A，C組有所降低（P<0.05）。

2.3 組織學觀察

HE染色后，光鏡下對照組D組大鼠視網膜表面光滑，組織形態(tài)未見明顯異常，各層細胞排列規(guī)則，結構清晰，細胞核染色清晰（見圖1-D）;A組大鼠視網膜組織各層排列相對有序，視網膜神經節(jié)細胞層發(fā)現少許細胞溶解，視網膜內界膜略腫脹，表面不平、增厚，可見細胞水腫（見圖1-A）;B、C組大鼠視網膜各層組織結構較A組基本完整，視網膜神經節(jié)細胞層未見明顯細胞溶解，少許細胞水腫（見圖1-B、圖1-C），有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而B、C兩組對比無顯著差異，無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

Image J軟件厚度測定顯示，A、B、C、D四組視網膜內顆粒層厚度分別為26.221±2.813 μm、30.082±1.007 μm、29.842±1.114 μm、31.893±1.239 μm。四者相比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。A、B、C組視網膜內顆粒層厚度較D組下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。B、C組視網膜內顆粒層厚度較A組略增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而B、C兩組間對比，結果無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.4 各組DR大鼠視網膜CTGF的表達比較

造模12周后，A、B、C三組大鼠視網膜組織中CTGF的表達水平均高于D組。與D組大鼠比較，A組大鼠視網膜CTGF水平明顯增高，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.001）;與A組大鼠比較，B組大鼠視網膜CTGF顯著降低，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.001），C組CTGF水平低于A組，有統(tǒng)計學意義;C組CTGF水平較B組稍高，但兩組對比無顯著差異（P>0.001），提示DR模型大鼠視網膜組織中CTGF表達與病情成正相關，菊米提取物可顯著減少視網膜組織中CTGF的表達（P<0.001），結果見表3、圖2。

3 結論與討論

中醫(yī)學認為DR屬消渴目病范疇，病機為“燥熱灼傷目中血絡”導致視網膜出血、滲出等一系列炎癥病變，因此治法以活血化瘀為主， 兼疏肝理氣、益氣養(yǎng)陰、滋補肝腎等原則[11-12]。而西醫(yī)則以控制血糖或玻璃體腔注射藥物治療為主，有的可進行激光手術，但屬于有創(chuàng)性介入，易帶來視力下降、視網膜水腫以及視野損害等問題，影響DR患者生活質量和預后。

菊米提取物具有清火明目、平肝降壓、降低血脂等作用，但其作用機制尚未有明確報道，可能與含有菊米內酯、黃酮甙等活性成分有一定的關系[2-3，13]。本實驗結果發(fā)現菊米提取物組大鼠的體質量、血糖等身體機能好于糖尿病組，與羥苯磺酸鈣組大鼠有一定相似性，提示菊米提取物在DR大鼠的血糖調節(jié)及體重控制上有一定的作用。CTGF作為一種致纖維化因子，在DR患者的視網膜增殖過程中起著主導地位，其通過誘導毛細血管基底層增厚、周細胞丟失，導致后期新生血管，大量炎性介質釋放，從而使血-視網膜屏障功能破壞，纖維組織增生，形成纖維血管膜，最后發(fā)展到增殖性糖尿病視網膜病變階段[14]，導致視力下降甚至失盲。已有研究發(fā)現DM大鼠視網膜CTGF的表達在8周時就顯著高于正常大鼠視網膜[15];CTGF基因敲除的小鼠，視網膜毛細血管周細胞丟失、基底層增厚得到有效控制[16];而DR患者CTGF的表達也顯著高于非糖尿病患者[17]，這些都表明CTGF的升高與DR血管增生程度呈現正比關系。本研究的結果顯示，菊米提取物組大鼠12周時視網膜神經細胞層的組織完整性好于糖尿病組，且視網膜CTGF表達水平比糖尿病組大鼠水平低，說明菊米提取物組大鼠血管增生程度有所下降，菊米提取物對早期DM大鼠視網膜組織結構具有一定的保護作用。因此，如果在糖尿病視網膜病變早期開始進行菊米提取物干預，一定程度上可延緩大鼠糖尿病進程及微血管病變，減輕DR大鼠的視網膜纖維化狀態(tài)，保護視網膜組織的損傷。此外，本研究結果也發(fā)現菊米提取物組與羥苯磺酸鈣組的大鼠在視網膜細胞完整性及視網膜CTGF濃度水平方面相差不大，說明菊米提取物與羥苯磺酸鈣在保護視網膜組織的作用上存在藥物平行性，這可為菊米在臨床上治療糖尿病視網膜病變患者時進行聯(lián)合用藥提供一定的參考。

由于菊米含有多種生物活性成分，加之樣本數量有限、試驗動物的生物性多樣等因素，后續(xù)需要在菊米相關有效成分的作用機制上進行深入探討，并可通過直接眼底鏡檢查及視網膜神經節(jié)細胞凋亡情況等方面觀察在藥物干預下DR的病情進展。

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