口腔鱗癌葉酸表達(dá)的臨床病理分析

楊艷 陳盛 蒲玉梅 王育新

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)，簡稱口腔鱗癌，是口腔頜面-頭頸部最常見的上皮源性惡性腫瘤。除手術(shù)治療外，化療是治療OSCC的主要方法之一，尤其對于晚期OSCC患者或不能耐受手術(shù)治療的患者，化療可能延長患者生命。

目前非靶向化療存在靶向性差，系統(tǒng)毒性高等缺點，以VEGF、EGFR等為靶點的主動靶向化療逐漸受到臨床醫(yī)師和患者的關(guān)注[1-3]。葉酸受體(folate receptor，F(xiàn)Rα)在正常組織中往往低表達(dá)，而在卵巢癌、肺癌等大多數(shù)腫瘤組織中高表達(dá)，因此以FRα為靶點的靶向化療成為研究熱點[4-6]。目前OSCC中葉酸表達(dá)仍不明確，本研究通過分析不同分型、臨床分期、腫瘤浸潤方式中FRα表達(dá)并分析其與患者預(yù)后相關(guān)性，為FRα靶向治療OSCC提供臨床病理學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科2012 年1 月～2013 年12 月就診并行手術(shù)治療的OSCC患者，甲醛固定石蠟包埋組織標(biāo)本95 例，同一患者術(shù)后切緣病理證實為正常口腔黏膜組織標(biāo)本作為對照組。所有患者術(shù)前均未接受放化療、激素及其他輔助治療，術(shù)后診斷均經(jīng)病理證實。

1.2 臨床隨訪

對95 例OSCC患者均進行隨訪，隨訪時間最短為6 個月 , 最長為80 個月, 平均隨訪時間31.3 個月。分析所選患者性別、發(fā)病部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、病理分級對患者預(yù)后的影響及與葉酸表達(dá)之間的相關(guān)性。

1.3 免疫組化

采用兔抗人FRα單克隆抗體(Abcam，英國)。以1∶100稀釋的山羊IgG為陰性對照。采用免疫組化方法對石蠟包埋的OSCC標(biāo)本進行免疫組化分析。具體方法如下：二甲苯脫蠟后，梯度乙醇水化，抗原修復(fù)方法是：EDTA修復(fù)液(pH 9.0)的電磁爐中加熱，煮沸后計時15 min，然后冷卻至室溫(約20 min)。磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗后，山羊血清封閉10 min，不洗，甩干，以1∶100稀釋的抗FRα一抗4 ℃冰箱孵育過夜，用PB沖洗。然后用K5007二抗(DAKO，丹麥)在室溫下孵育20 min，PBS沖洗3 次，每次3 min，DAB顯色，鏡下控制顯色時間。最后用蘇木精復(fù)染1 min，自來水沖洗1 min，鹽酸乙醇分化3 s，自來水沖洗3 min，1%碳酸鋰藍(lán)化，自來水沖洗3 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明封片，完成免疫組化。

1.4 FRα陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)

所有組織切片均由一名病理學(xué)家評估。切緣病理證實為正常口腔黏膜上皮亦被評估并分級。FRα陽性表達(dá)為發(fā)生特征性的膜和細(xì)胞質(zhì)免疫反應(yīng)，胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。采用免疫組化評分法進行分析。依據(jù)細(xì)胞染色強度分為未染色(0 分)、淡黃色(1 分)、棕黃色(2 分)、棕褐色(3 分)。隨機選擇5 個視野，依據(jù)陽性細(xì)胞所占比例分為0%～1%(0 分)、2%～10%(1 分)、11%～50%(2 分)、51%～80%(3 分)、81%～100%(4 分)[7](圖 1)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Mann-Whitney秩和檢驗比較不同性別，不同病理分級，不同浸潤方式，不同T分期，不同部位，及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的FRα表達(dá)情況。采用Kaplan Meier曲線和log-rank檢驗將各組患者FRα表達(dá)與DFS、OS進行相關(guān)性分析。P<0.05在所有分析中被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖 1 FRα在OSCC組織標(biāo)本中的表達(dá)(IHC)

2 結(jié) 果

2.1 臨床病理資料

對95 例OSCC患者病理標(biāo)本進行分析。其中68 例(71.6%)病理證實無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，27 例(28.4%)存在頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。年齡范圍29～82 歲，中位年齡60.25 歲，男女比例約1.26∶1。病理分級為低分化4 例(4.2%)，中分化59 例(62.1%)，高分化32 例(33.7%)。腫瘤浸潤方式(worst pattern of invasion,WPOI)： WPOI 1～3 級66 例(69.5%)，WPOI 4～5級29 例(30.5%)。T分期：T 1-2為21 例(22.1%)，T3為63 例(66.3%)，T4為11 例(11.6%)。腫瘤原發(fā)部位：舌40 例(42.1%)，頰21 例(22.1%)，口底9 例(9.5%)，牙齦19 例(20%)，腭部6 例(6.3%)。

2.2 臨床隨訪資料

所有OSCC患者中位生存時間為3.89 年。3 年和5 年的總生存率(overall survival,OS)分別為72.6%和71.5%，3 年和5 年的無病生存率(disease-free survival,DFS)分別為74.7%和73.1%。

2.3 FRα的表達(dá)情況及與OS，DFS的相關(guān)性

所有OSCC患者葉酸表達(dá)情況分為3 組：FRα 0-1為低表達(dá)組，F(xiàn)Rα 2-3為中表達(dá)組，F(xiàn)Rα4為高表達(dá)組。低表達(dá)組為40 例(42.1%)，中表達(dá)組46 例(48.4%)，高表達(dá)組(9.5%)(圖 2)。

圖 2 OS及DFS與WPOI分級和FRα表達(dá)差異的相關(guān)性

表 1 臨床病理資料與葉酸表達(dá)相關(guān)性

FRα表達(dá)在男女間無顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.304)，腫瘤原發(fā)部位間無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.846)，而在病理高、中、低分化間(P=0.017)，浸潤方式間(P=0.036)，T分期(P=0.002)，術(shù)前淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者與非轉(zhuǎn)移患者間有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.005)(表 1)。

FRα表達(dá)量與5 年OS呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)Rα高、中、低表達(dá)分別為33.4%、79.4%、90.1%(P=0.000 3)；FRα表達(dá)量與5 年DFS方面也呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)Rα高、中、低表達(dá)分別為44.7%、82.9%、69.5%(P=0.033 6)。

3 討 論

葉酸在細(xì)胞快速分裂和生長中起著重要作用，如參與嘌呤、嘧啶的合成，進一步合成DNA和RNA；參與多種氨基酸的代謝等。FRα能夠以胞吞的形式將葉酸運輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)，癌細(xì)胞為了滿足自身合成的需要，可能通過上調(diào)FRα的表達(dá)量提高其對葉酸的攝取能力。FRα分為3種亞型FRα、FRβ 和 FRγ。FRα表達(dá)于大部分癌癥組織的上皮細(xì)胞中，而絕大多數(shù)正常細(xì)胞(除腎臟、胎盤)其表達(dá)量極低；FRβ在非上皮組織的癌癥細(xì)胞中過表達(dá)(髓細(xì)胞性白血病、惡性肉瘤)，而在造血細(xì)胞和非上皮細(xì)胞(脾臟、胸腺)表達(dá)量不高；FRγ在人體內(nèi)分布較少。研究表明FRα過表達(dá)的癌癥包括卵巢癌、肺癌、腎癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、腦癌、結(jié)腸癌等[8-10]，F(xiàn)Rα已成為腫瘤靶向治療的靶點。然而，OSCC的FRα研究少見且具有爭論[11-12]。

本研究表明，F(xiàn)Rα在OSCC中有相當(dāng)比例的表達(dá)，且其FRα表達(dá)量與病理分級，WPOI，腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間存在相關(guān)性，這表明FRα表達(dá)可能是一種更具侵襲性的腫瘤表型的標(biāo)志物。

影響OSCC患者OS和DFS的因素包括病理分級、WPOI、腫瘤臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤厚度等。本研究將葉酸表達(dá)量與患者臨床病理資料分別行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)FRα表達(dá)在性別與腫瘤原發(fā)部位之間無統(tǒng)計學(xué)意義，而在病理高、中、低分化之間(P=0.017)，浸潤方式之間(P=0.036)，T分期(P=0.002)，術(shù)前淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者與非轉(zhuǎn)移患者之間有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.005)，由此證明葉酸表達(dá)與腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性。分析原因，考慮葉酸是細(xì)胞快速分裂和生長中所必須，因此腫瘤細(xì)胞在增殖分化、轉(zhuǎn)移中需要大量的葉酸來參與能量代謝。Ki-67人體中增生細(xì)胞核中的標(biāo)志性抗原，能比較準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的增殖情況。有文獻(xiàn)證實葉酸表達(dá)與Ki-67存在高度相關(guān)性[13]，由此證明葉酸也可作為一種重要的觀察癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移能力的指標(biāo)。

以FRα為靶點的靶向給藥策略，在新型抗腫瘤藥物的研究和開發(fā)中已顯示出廣闊的應(yīng)用前景。因此了解FRα在OSCC和其他惡性腫瘤中的存在和表達(dá)水平可以為更好的治療提供依據(jù)。然而國內(nèi)外對于OSCC組織中FRα的表達(dá)情況報道少見。Saba等[11]報道了FRα表達(dá)于頭頸鱗癌中，且FRα高表達(dá)與較差預(yù)后相關(guān)，而Sun等[12]發(fā)現(xiàn)在頭頸鱗癌病理標(biāo)本中，巨噬細(xì)胞FRα高表達(dá)，癌細(xì)胞為低表達(dá)甚至不表達(dá)。由此可見，F(xiàn)Rα在頭頸鱗癌的表達(dá)情況存在爭論，使得FRα靶向化療在OSCC中的應(yīng)用缺乏臨床依據(jù)。本研究中發(fā)現(xiàn)在OSCC中FRα0不表達(dá)占13.6%、FRα1占28.4%，而FRα2-4占57.8%，且其表達(dá)高低與腫瘤病理分化程度、浸潤方式、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在正相關(guān)性。進一步分析葉酸表達(dá)與OSCC生存預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)FRα表達(dá)與患者的OS和DFS亦存在相關(guān)性，F(xiàn)Rα高表達(dá)提示患者預(yù)后較差，因此FRα表達(dá)量或許可以作為一個判斷臨床預(yù)后的免疫組化指標(biāo)。確定FRα在OSCC中的表達(dá)情況，不僅可以預(yù)測OSCC預(yù)后，而且為OSCC精準(zhǔn)治療提供了可能。

受體介導(dǎo)的腫瘤靶向成像和治療是以腫瘤細(xì)胞表面特異性的受體為靶點，以受體為對應(yīng)的配體結(jié)合物為載體，利用兩者特異性反應(yīng)，最終實現(xiàn)腫瘤主動靶向。在納米藥物輸送抗腫瘤藥物的靶向劑中，F(xiàn)Rα是一種常用且有效的靶向受體[14]。FA和FRα(Kd～0.1 nmol/L)之間的高親和度將會導(dǎo)致FRα過表達(dá)的癌細(xì)胞增加對治療藥物的攝取[15]。Zhu等[16]應(yīng)用葉酸靶向的聚合物囊泡負(fù)載紫杉醇和阿霉素聯(lián)合化療肝細(xì)胞癌，在FA高表達(dá)的BEL-7404肝癌細(xì)胞株造模的裸鼠上獲得極佳的抗腫瘤效應(yīng)。Van等[17]利用FRα靶向脂質(zhì)體納米復(fù)合物治療乳腺癌，在動物模型亦獲得成功。Wang等[18]制備葉酸靶向溫度敏感磁性脂質(zhì)體成功治療卵巢癌。上述研究均證實FA靶向腫瘤特異性聚集，減少了對正常細(xì)胞毒性，改善了化療藥物的生物利用度。

本研究結(jié)果提示以FRα介導(dǎo)的靶向治療OSCC具有病理學(xué)基礎(chǔ)。