hBD-3在口腔黏膜下纖維性變癌變過程中的表達研究

楊琴 杜永秀 翦新春 楊晨希 徐普

口腔黏膜下纖維性變(oral submucosal fibrosis，OSF)是一種慢性進行性具有癌變傾向的黏膜炎性疾病，其病因不明，可能與咀嚼檳榔、免疫失調、膠原代謝紊亂、細胞自噬水平異常等有關[1-2]。Pindborg等[3]報道OSF癌變率約為7% ～13%，并提出OSF與口腔癌共存時實際上是OSF癌變所致。目前關于OSF癌變機制尚不明確。人β-防御素-3(human β-defensin-3，hBD-3)是先天性免疫系統的重要組成部分，具有多種生物學活性，在炎癥性疾病、損傷修復、局部免疫調節以及腫瘤形成和轉移中均發揮重要的作用[4]。已有學者證明hBD-3在多種口腔黏膜癌前病變及口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)中呈高表達，認為其可能參加這些病變的發生及轉歸[5-7]。但有關其在OSF中的研究未見報道。本實驗試圖通過免疫組織化學及實時熒光定量PCR的方法從基因和蛋白水平上檢測正?？谇火つ?、OSF及伴OSF口腔鱗癌組織中hBD-3的表達水平，探討hBD-3在OSF的發生及其癌變過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2017 年9 月～2018 年12月在中南大學湘雅醫學院附屬?？卺t院口腔醫學中心就診及住院的OSF患者22 例，伴OSF的口腔鱗癌患者13 例。對照組選取10 例正常的口腔黏膜，取自該院口腔外科拔除埋伏阻生牙的健康口腔黏膜，患者無咀嚼檳榔史。所有的新鮮組織用生理鹽水沖洗后分為2 份：一份置于-80 ℃低溫冰箱保存，另一份送往病理科石蠟包埋行HE染色確診。所有病例術前未經激光、放療、化療和局部藥物注射等治療，無其他系統性疾病。本研究已通過醫學倫理審查。

1.2 主要實驗試劑

兔抗人hBD-3多克隆抗體(NOVUS，美國)；即用型快捷免疫組化Max VisionTM試劑盒(福州邁新生物技術有限公司)；RNA抽提試劑(Invitrogen，美國)；Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(TB.Ⅱ，Takara，日本)；GAPDH內參、hBD-3引物(上海生工生物技術有限公司)。hBD-3引物序列(上游5'-TTCTGTTTGCTTTGCTCTTCCTG-3'，下游5'-ACTTGCCGATCTGTTCCTCCTT-3')。

1.3 檢測方法

1.3.1 免疫組織化學 石蠟包埋的待測組織切片脫蠟水化，3%的過氧化氫甲醇中孵育10 min，檸檬酸鈉高壓鍋修復，山羊血清封閉10 min，滴加hBD-3一抗(1∶400)后4 ℃過夜，二抗孵育15 min，DAB顯色，復染，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察并拍照。用銀屑病石蠟塊做陽性對照，PBS代替一抗作空白對照，根據參考文獻[8]對標本進行評分：①陽性細胞比例打分：<5%記為0 分，5%～24%記為1 分，25%～49%記為2 分，50%～75%記為3 分，>75%記為4 分；②染色強度評分：無(-)，弱(+)，中等(++)，強(+++)，分別記為0～3 分；③標本免疫組化評分為上述2 項得分之和，得分0～1 分記為陰性(-)，2～3 分為弱陽性(+)，4～5 分為陽性(++)，6～7 分為強陽性為(+++)。

1.3.2 實時熒光定量PCR 將凍存的新鮮組織稱重后用玻璃研磨器進行研磨，按Trizol說明書提取總RNA，檢測RNA濃度及純度，使用Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒逆轉錄成 cDNA(-80 ℃儲存備用)。以GAPDH為內參，按TB Ⅱ說明書在冰上操作，配制20 μl反應體系，TB Ⅱ 10 μl，上下游引物各0.8 μl，滅菌水6.4 μl , 模板2 μl。循環時間為：95 ℃ 30 s 1 個循環，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s 40 個循環，95 ℃ 5 s、60 ℃ 1 h 1 個循環。每個樣本3 個復孔取平均值，采用2-ΔΔCT法進行分析。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 hBD-3蛋白表達

圖 1為3 組的HE染色，圖 2為hBD-3的免疫組化染色，結果示：hBD-3主要定位于上皮細胞胞質及胞核中，呈黃色或深黃色染色顆粒。正?？谇火つぶ衕BD-3主要分布于基底層和附近的棘層，主要表達在胞漿中；OSF組織中hBD-3染色范圍擴大，陽性細胞分布于基底層、棘層和顆粒層，染色加深，胞漿、胞核及胞膜均有表達，胞核更強；OSCC中hBD-3染色較強，其高表達的部位主要在癌變的區域，胞漿和胞核均有表達，尤以胞核更強。hBD-3在正?？谇火つぁSF、伴OSF口腔鱗癌組織中陽性表達率為40.00%(4/10)、86.36%(19/22)、100.00%(13/13)，差異具有統計學意義(P<0.05)。具體表達情況見表 1。

2.2 hBD-3mRNA的相對表達量

10 例正?？谇火つ?、22 例OSF及13 例伴OSF口腔鱗癌組織中hBD-3 mRNA相對表達量分別為1.06±0.37，1.73±0.21，7.07±0. 88。其中伴OSF口腔鱗癌組織中hBD-3 mRNA表達水平明顯高于正常對照組及OSF組，差異均具有統計學意義(P<0. 05)，OSF組中hBD-3 mRNA表達水平高于正常對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)(圖 3)。

圖 1 3 組的HE染色圖片(×200)

圖 2 hBD-3的免疫組化染色結果(×400)

表 1 3 組hBD-3表達強度的比較

圖 3 3 組樣本中hBD-3相對表達量

3 討 論

hBD-3是人先天免疫屏障的重要組成部分，定位于人第8號染色體的p22～23區域內，于2001年首先在銀屑病患者皮損中發現，正常情況下hBD-3呈低表達，當機體處于感染或炎癥時，其表達水平會顯著增加，進而通過直接殺滅病原微生物以及激活或趨化免疫細胞至炎癥部位來發揮其免疫防御作用[9]。研究表明，hBD-3在多種腫瘤組織中存在高表達，如外陰部惡性腫瘤，宮頸癌，頭頸部鱗狀細胞癌等，過表達的hBD-3能夠影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲遷移等生理過程從而促進腫瘤的發生發展[10-12]。目前有關hBD-3促癌作用的分子機制尚不明確。有學者發現過表達的hBD-3能夠與趨化因子受體結合募集腫瘤相關巨噬細胞至黏膜下、誘導促腫瘤因子和炎癥因子的釋放，構建腫瘤相關炎癥微環境從而促使細胞異常增殖[6,13]。亦有學者報道過表達的hBD-3能通過激活ERK1/2、PI3K/AKT及NF-KB等腫瘤相關信號通路從而影響腫瘤發生發展[12,14]。

OSF是一種與咀嚼檳榔有關的具有癌變傾向的疾病，其主要病理特征為近上皮端炎癥反應、進行性黏膜下膠原沉積變性及上皮萎縮，從而引起黏膜硬化、形成條索，最終出現張口受限等臨床癥狀。長期咀嚼檳榔所導致的黏膜慢性炎癥以及成纖維細胞過度增殖和功能活化是OSF形成的重要原因。本文通過免疫組化及實時熒光定量PCR技術對hBD-3在OSF中的表達情況做了初步探討，結果表明OSF組織中hBD-3基因和蛋白表達水平顯著高于正?？谇火つ?P<0.05)，提示hBD-3可能參與了OSF發生。檳榔體積較大，質地較硬，長期嚼食檳榔勢必會損傷口腔黏膜，導致上皮屏障受損，機體會分泌大量的炎癥細胞因子以及炎性介質從而誘導hBD-3表達上調。過表達的hBD-3可能對OSF發生也有一定影響。研究表明，hBD-3具有雙向免疫調節功能，低濃度時抑制炎癥因子的表達，高濃度時傾向于促進炎癥因子的釋放[4]。此外，hBD-3能夠促進肥大細胞活化和脫顆粒，而肥大細胞的功能活化可以干擾組織膠原代謝而促進OSF形成[15-16]。體外實驗進一步表明hBD-3能促進成纖維細胞的增殖[17]。

OSF作為一種癌前狀態，可發展為口腔鱗狀細胞癌。Kesting等[7]通過對45 例口腔鱗癌患者與健康人hBD-3 mRNA及其蛋白表達的檢測，發現在鱗癌組織中hBD-3 mRNA與蛋白的表達量明顯高于健康人。體外實驗表明過表達的hBD-3能促進口腔鱗狀細胞癌株的增殖及遷移，扮演著原癌基因的作用[18]。本研究顯示：正?？谇火つ?、OSF組織以及伴OSF口腔鱗癌組織3 組中hBD-3基因和蛋白表達水平呈逐漸增高的趨勢(P<0. 05)，hBD-3在伴OSF口腔鱗癌組織較OSF組織中的表達水平明顯升高，提示hBD-3可能與OSF癌變有關。其可能的致癌機制為：在檳榔等長期刺激下，導致口腔黏膜屏障受損以及黏膜下炎性滲出，機體通過多條信號轉導途徑上調hBD-3表達，過表達的hBD-3能通過激活NF-KB等腫瘤相關信號通路以及構建腫瘤相關炎癥微環境參與OSF癌變。

炎癥與腫瘤的發生密切相關，因此尋找炎癥環境下特異性的生物標志物也非常重要，因其可能有助于識別早期癌前病變，預測疾病的發展、評估疾病的預后。hBD-3作為一種炎癥因子，已被認為是潛在的口腔癌生物標志物[19]。本研究以hBD-3作為實驗指標，觀察其在OSF癌變中的表達情況，對hBD-3在OSF癌變中的作用做初步的探討，以期為OSF發生及癌變的機制及早期診斷和治療方面提供更多的理論依據。