TiO2納米管表面對成骨細胞與巨噬細胞黏附、形態及遷移的影響

劉婧 孫華 何奕德 宋文 張玉梅

鈦種植體因其良好的生物相容性和機械性能而廣泛應用于口腔種植領域。為了獲得更加快速、穩固的骨結合，鈦表面改性成為國內外研究的熱點[1]。鈦表面的納米管形貌可模擬天然骨組織中的納米晶體結構，具有促成骨、調節骨免疫等生物學效應[2-3]，但其對不同類型細胞的調控機理仍不明確。研究表明，細胞黏附、遷移等行為特征是其增殖、分化并發揮功能的前提和基礎。成骨細胞的成骨分化與細胞的黏附和增殖密切相關，而巨噬細胞的黏附及形態則影響其極化的方向和免疫調控功能的發揮[4-5]。因此，本研究通過陽極氧化法在鈦表面制備納米管形貌，分別研究了其對成骨細胞、巨噬細胞的早期黏附、細胞形態和遷移運動的影響，為進一步理解納米形貌調控細胞的內在機理及種植體表面形貌設計提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料

純鈦片(10 mm×10 mm×1.5 mm，西北有色金屬研究院)；碳化硅砂紙(STARCKE,德國)；無水乙醇、丙酮、氫氟酸(天津富宇精細化工有限公司)；戊二醛(北京雷根生物技術有限公司)；Hoechst33342(上海碧云天生物技術有限公司)；ɑ-MEM培養基、高糖DMEM培養基、胎牛血清(Gibco，美國)；青霉素/鏈霉素、胰蛋白酶(Sigma，美國)；磷酸鹽緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 主要儀器

超聲波清洗器(KQ250B，昆山市超聲波儀器有限公司)；陽極氧化電源(MATSUSADA，日本)；磁力加熱攪拌器(上海帥登儀器有限公司)；超凈工作臺(蘇州凈化)；細胞培養箱(Thermo，美國)；掃描電子顯微鏡(S-4800，Hitachi，日本)；熒光顯微鏡(IX71)、活細胞工作站(IX81-ZDC)(Olympus,日本)。

1.3 鈦試樣制備及表征

方形鈦片經800～5000 目碳化硅砂紙序列打磨拋光后，得到表面光滑的鈦試樣(P)并將其作為對照組；在20 V電壓下及含0.5%氫氟酸溶液的電解液中，以表面光滑的純鈦試樣為陽極，石墨電極為陰極，陽極氧化1 h，得到表面有TiO2納米管的鈦試樣(NT)并將其作為實驗組。將制備好的鈦試樣依次經丙酮、無水乙醇、去離子水超聲蕩洗并真空干燥后，于場發射掃描電子顯微鏡下觀察其表面形貌。所有試樣在接種細胞前，均使用75 %乙醇浸泡及紫外線照射消毒。

1.4 細胞培養

小鼠成骨細胞系MC3T3-E1(ATCC,美國)用含10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的ɑ-MEM培養基培養，每48 h換液1 次；小鼠巨噬細胞系RAW264.7(ATCC,美國)用含10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的高糖DMEM培養基培養，每24 h換液1 次。將細胞置于37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養，待細胞密度為80%左右時傳代，取對數生長期細胞用于后續實驗。

1.5 細胞形態觀察

將P組和NT組鈦試樣置于24 孔板中，將成骨細胞和巨噬細胞按2×104個/孔的密度分別接種于各組鈦試樣表面，在接種3、6、12、24、48 h后終止培養。PBS漂洗細胞3 次，2.5%戊二醛固定過夜，依次用30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇脫水10 min，六甲基二硅胺烷再脫水30 min，真空干燥后即刻噴金，掃描電鏡下觀察細胞形態。

1.6 細胞黏附計數

細胞接種方法同1.5，分別在細胞接種3、6、12、24 h時終止培養，PBS漂洗3 次，4%多聚甲醛固定過夜，Hoechst 33342染色后熒光顯微鏡下拍照，使用Image J軟件計數細胞。

1.7 細胞遷移軌跡追蹤

細胞接種方法同1.5，待細胞貼壁后轉移至活細胞工作站內繼續培養，每30 min拍照1 次，連續拍照24 h，將所得細胞時間序列圖像生成視頻，并經Image J軟件處理得到細胞遷移軌跡。

1.8 統計學分析

采用SPSS 18.0統計軟件對實驗數據進行統計學分析。每個獨立實驗重復3 次，采用獨立樣本t檢驗分析組間差異，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 鈦試樣表面形貌觀察

掃描電鏡放大1 000 倍后可見，P組鈦表面較為光滑，僅有少量劃痕，NT組鈦表面為云霧狀形態；放大100 000 倍后可見，P組鈦表面光滑無雜質，NT組鈦表面為均勻排列的直徑約80 nm的納米管陣列(圖 1)。

圖 1 鈦試樣表面形貌

2.2 細胞形態觀察

SEM觀察顯示：成骨細胞在2 組鈦試樣表面的細胞鋪展均為不規則的多邊形。NT組表面細胞邊緣多為鋸齒狀且絲狀偽足豐富，而P組表面細胞邊緣較為光滑，多為板狀偽足。巨噬細胞在2 組試樣表面形態均近似為球形，細胞伸出絲狀偽足。NT組表面細胞偽足較短且稀少，而P組表面細胞偽足較長且豐富(圖 3)。

2.3 細胞黏附統計

如圖 2所示。成骨細胞和巨噬細胞在鈦試樣表面的黏附數量均隨著時間的延長而增多；在相同時間點，成骨細胞的黏附數量為NT組>P組，巨噬細胞的黏附數量為NT組

圖 2 細胞接種試樣表面3、6、12、24 h后細胞核熒光染色和定量分析(×40)

圖 3 細胞接種試樣表面3、6、12、24、48 h后的形態學觀察

2.4 細胞遷移軌跡及速率統計

成骨細胞和巨噬細胞在鈦試樣表面均為無特定方向的不規則運動，但二者在不同形貌鈦試樣表面的遷移速率有所差異：成骨細胞在納米管形貌上較光滑鈦表面遷移緩慢，而巨噬細胞在納米管形貌上較光滑鈦表面遷移更為迅速(圖 4)。

圖 4 細胞在鈦試樣表面的遷移軌跡

3 討 論

鈦種植體表面改性可以加快種植體植入體內后的骨愈合過程，縮短種植周期。常用的方法有噴砂酸蝕、激光處理、陽極氧化、涂層技術等[1]。本研究采用陽極氧化法，通過控制電壓及陽極氧化的時間在鈦表面制備了管徑均一的納米管形貌。該方法操作簡便，可重復性強，為后續的細胞行為學評價提供了穩定可靠的材料模型。之后探討了成骨細胞和巨噬細胞在不同形貌鈦表面的黏附、形態及遷移運動的差異。

種植體的骨愈合過程涉及多種細胞的參與。種植體植入后，其表面迅速吸附纖維蛋白并形成血痂。之后，血液中的中性粒細胞、單核-巨噬細胞遷移至此發揮免疫調節作用。干細胞、成骨細胞黏附在種植體表面并不斷分化形成新骨，破骨細胞在骨愈合中后期發揮著骨改建作用。種植體表面形貌的不同會影響細胞的行為；不同的細胞種類由于其所行使功能的不同，對同一種表面形貌的反應也會有所區別。研究表明，成骨細胞能夠在納米管表面快速黏附增殖并伸出大量絲狀偽足，該絲狀偽足可以幫助其錨定在納米管上[6-8]。本研究發現，成骨細胞在納米管表面的黏附能力明顯強于光滑鈦表面，納米管表面細胞的絲狀偽足更為豐富，光滑表面細胞則有較多的邊緣光滑的板狀偽足，這與前述研究結果一致[9]。細胞的黏附依賴于黏著斑的形成。由于納米管的中空結構，培養液中的蛋白質主要吸附于納米管管壁，為細胞黏著斑提供錨定位點[10]。成骨細胞的細長絲狀偽足可能是為了不斷伸展以尋找更合適的黏附位點[11]。與成骨細胞不同，發現巨噬細胞在納米管表面的黏附數量及絲狀偽足數量相較于光滑表面顯著降低。有研究認為，鈦基底經納米管修飾后表面親水性和負電性升高[12-13]，而帶負電的親水性生物材料表面能夠抑制單核-巨噬細胞的黏附且促進成骨細胞的黏附[14-15]。產生該現象可能的原因是親水性和負電性的材料表面缺乏巨噬細胞黏附和伸展所需的整合素結合位點[16-17]。

本研究比較了細胞在不同形貌的鈦表面遷移運動的差異。由于成骨細胞在納米管表面黏附能力較強，其遷移速率明顯較光滑表面的細胞緩慢。相反的，納米管表面的巨噬細胞遷移運動更為明顯。細胞的遷移運動是需要細胞形態高度協調變化，同時與其細胞外基質不斷相互作用的過程。該過程可以分為4 個獨立的步驟：細胞前緣伸展并黏附于細胞外基質，細胞骨架收縮并產生牽引力，細胞后緣黏附斑的解聚和細胞體的移動[18]。由此可見，細胞的遷移能力是與細胞黏附密切相關的，細胞黏附力越強，細胞遷移運動則越少。另外，細胞的遷移和分化是兩個相互競爭的過程[19]，成骨細胞的遷移停止以及有效的黏附定植，有利于細胞進行下一步的成骨分化[20]。上述實驗結果也在一定程度上也解釋了納米管形貌表面具有更好的促成骨效應的原因[21]。近年來，通過材料表面的納米形貌控制細胞的黏附和遷移行為，進而調控其功能發揮，成為材料表面修飾的熱點[20]。細胞通過黏著斑等黏附相關蛋白與材料直接接觸，能夠感知基底形貌的差異并作出相應的反應。本研究發現納米形貌表面的成骨細胞黏附能力更強，遷移速率更低，而巨噬細胞則與之相反，其內在機理仍有待于進一步研究。