新型根管充填材料HiFlow的體外細胞毒性研究

戴怡茹 楊健

根管治療經過預備和消毒，根管內仍可能存有病原微生物，根管充填是根管治療的重要步驟，其最終目標是以生物相容性良好的材料嚴密充填根管，封閉根尖孔，占據病原微生物可能存在的空腔[1]。目前，臨床上常用的根管充填材料為核材料和根管封閉劑[2]。根管系統的結構非常復雜，根管封閉劑的使用至關重要[3]。理想的根管充填材料不僅要有長久的封閉性、體積穩定不收縮、一定的抗菌作用、X線阻射性和不使牙變色等特點，同時要具有良好的生物相容性[4]。目前臨床常用的根管封閉劑按其成分可分為：氧化鋅丁香油類、氫氧化鈣類、樹脂類和近年來以iRoot?SP為代表的生物陶瓷類。以 iRoot?SP為代表的生物陶瓷類根管封閉劑具有良好的抗菌性、根尖封閉性和生物相容性[5-6]，由于iRoot?SP 封閉劑的最佳加熱溫度尚無明確定論，產品說明書推薦使用單尖充填技術。EndoSequence?BC SealerTMHiFlow(HiFlow,Brasseler USA, 美國)是Brasseler USA公司專為使用熱牙膠垂直加壓充填法而設計的一種新型生物陶瓷類根管封閉劑。目前還沒有關于HiFlow生物相容性的相關研究。本研究采用CCK-8法對比HiFlow、AH Plus、iRoot?SP、MTA 4 種根充材料對L929細胞的細胞毒性，評價HiFlow對L929細胞的細胞毒性作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

HiFlow(Brasseler USA，美國)；AH Plus、MTA(Dentsply，德國)；iRoot?SP(Innovative Bioceramix Inc，加拿大)；L929細胞(南昌大學公衛實驗室饋贈)；胎牛血清(四季青)；DMEM高糖培養基(Solarbio)；胰蛋白酶、CCK-8試劑盒(TransGen Biotech)；細胞計數板(QIUJING)；超凈臺(AIRTECH)；恒溫培養箱(37 ℃、濕度95%、含5%CO2)(Thermo，德國)；倒置相差顯微鏡(Optec)；酶標儀(PerkinElmer，EnSpire，美國)。

1.2 細胞培養

將L929細胞復蘇后接種于培養瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基，置于培養箱內培養48 h后換液，繼續培養至細胞長滿培養瓶底約80%～90%后用胰蛋白酶消化傳代，繼續培養至3～4 代。

1.3 浸提液制備

在無菌條件下將HiFlow、調和的AH Plus、iRoot?SP、調和的MTA置于模具中制成直徑約5 mm，厚度約2 mm的圓片樣本，每組根管充填材料制備4 個樣本，置于培養箱內固化24 h。固化后的每組樣本分別加入1 ml浸提介質(含10%胎牛血清的L929細胞培養基)，置于培養箱內24 h后取出樣本。浸提液用于CCK-8實驗。

1.4 CCK-8實驗

取處于對數生長期末的第3～4代細胞，用胰蛋白酶消化分散，使用細胞計數儀調整細胞密度為5×104個/ml，取24 孔板1塊，以1 ml/孔接種細胞懸液，分別測定24、48、72、96、120 h細胞數目，每時段設4 個復孔，取均值繪制L929細胞生長代謝曲線。取96 孔板3 塊，以100 μl/孔接種細胞懸液，將培養板置于培養箱內預培養24 h。鏡下觀察細胞貼壁后，棄液。在A組、B組、C組、D組分別加入100 μl各組樣本浸提液至相應細胞培養孔中，E組(正常對照組)加100 μl細胞培養基，每組設4 個復孔，分別置于培養箱培養12、24、48 h后各取1 板，棄液，每孔加入100 μl細胞培養基和10 μl CCK-8試劑混合液，另設置4 孔為F組(空白組)：加入100 μl細胞培養基和10 μl CCK-8試劑混合液。將培養板置于培養箱內孵育3 h。用酶標儀測定各實驗組在450 nm處的吸光度，計算細胞相對增殖率。

1.5 細胞鑒定

各組根充材料浸提液培養L929細胞，分別于12、24、48 h后倒置顯微鏡觀察細胞狀態，并隨機拍照記錄48 h細胞形態變化。

1.6 統計學分析

所有檢測均由一名輔助人員盲法完成，實驗數據采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，采用單因素方差分析，雙側檢驗水準為α=0.05。

2 結 果

2.1 L929細胞生長曲線

72 h后，細胞增殖明顯減緩(圖 1)。

圖 1 L929細胞生長代謝曲線

表 1 各組根充材料浸提液培養L929細胞12、24、48 h的A值

2.2 CCK-8實驗

各組根充材料浸提液培養L929細胞12、24、48 h A值比較見表 1。不同根充材料浸提液培養L929細胞12、24、48 h細胞毒性總體差異有統計學意義(P<0.05)；其中B組與A組、C組、D組差異均有統計學意義(P<0.05)；12、24和48 h A組、C組和D組差異差異無統計學意義(P>0.05)。

各組根充材料浸提液培養L929細胞12、24、48 h細胞相對增殖率均值比較見圖 2。

2.3 各組樣本浸提液培養的L929細胞形態改變

培養48 h后倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態改變，結果如圖 3。E組細胞為正常長梭形、多角形，牢固地粘附于培養皿底，排列較密集，折光性強，胞內結構清晰。A組、C組和D組細胞形態呈長梭形、多角形，牢固貼壁于培養皿底，排列較密集，折光性較強，胞內結構清晰。B組部分細胞形態改變為球形，部分細胞懸浮不貼壁，細胞數目較少，部分細胞出現核皺縮，部分細胞結構破壞有細胞碎片。

圖 2 各組根充材料浸提液培養L929細胞12、24、48 h的細胞相對增殖率

圖 3 L929細胞與各根充材料浸提液培養48 h的細胞形態(相差顯微鏡, ×200)

3 討 論

由于根管峽部、側支根管、根尖分歧等不規則區域的存在，根管解剖形態復雜，單純核材料無法嚴密充填根管而導致根尖微滲漏的機會增加，根管封閉劑與核材料結合使用可獲得嚴密的三維效果的充填，因此根管封閉劑在根管充填過程中發揮著重要作用。在根管充填過程中，尤其是使用熱牙膠垂直加壓充填法，根管封閉劑容易被推出根尖孔，與根尖周組織直接接觸，其毒性作用的大小直接影響根尖周組織建立有利于愈合修復的環境。Oztan等[7]研究顯示根管封閉劑材料固化過程中會釋放物質至根尖周組織，Meryon[8]報道釋放物質的量與材料表面積相關聯。另外有研究[9]表明材料的釋放物質可以用材料的浸提液來表示，而浸提液的細胞毒性即可模擬根管封閉劑固化過程中釋放的物質對根尖周組織的毒性作用。根據以上結果，本實驗按照ISO 10993-5：1999標準制備浸提液用于比較HiFlow、AH Plus、iRoot?SP、MTA的生物相容性。

細胞毒性實驗具有敏感性高、簡便和研究周期短等優點，四甲基偶氮唑鹽微量酶反應色法(MTT法)是最早使用檢測材料的細胞毒性的比色法，Cell Counting Kit-8比色法(簡稱CCK-8法)為MTT法的替代法，兩者原理相同：將活細胞線粒體內的脫氫酶還原成甲臜，通過甲臜數量的檢測就可以反映細胞的活性，不同在于MTT法甲臜產物不溶于水，檢測需先用有機溶劑溶解，對細胞毒性高，而CCK-8法甲臜產物是水溶性的，對細胞基本無毒性，實驗操作步驟少、周期短，能有效地減少實驗過程中的污染，實驗結果更加靈敏和穩定[10-11]。因L929細胞易獲得、易存活且傳代周期短，在細胞毒性實驗中應用廣泛。故本實驗本研究采用CCK-8法評價HiFlow對L929細胞的細胞毒性。

CCK-8法顯示各組根充材料浸提液培養L929細胞12、24、48 h A值均顯示AH Plus的細胞毒性較HiFlow、iRoot?SP、MTA大，差異有統計學意義，這和以往將AH Plus的細胞毒性與MTA對比的研究結果一致，原因是AH Plus的主要成分是四氮六甲環和二甲酚A二環氧丙酯醚，A劑和B劑混合后四氮六甲環在水溶液環境中會分解為甲醛和胺，甲醛通過激活IL-6和IL-8基因的表達引起細胞變態反應使之存在一定的細胞毒性[12-14]。 HiFlow和iRoot?SP、MTA的細胞毒性類似，其12、24、48 h A值差異無統計學意義。MTA的主要成分為硅酸鹽水泥，反應產物硅酸鈣水合物(C-S-H)和氫氧化鈣釋放的Ca2+使其不論是對細胞還是骨均有良好的生物相容性，亦可促進成骨的發生，因此MTA的細胞毒性通常作為評價根充材料生物相容性的金標準[15-16]。iRoot?SP的主要成分為硅酸鈣、磷酸鈣、氫氧化鈣等，磷酸鈣和氫氧化鈣反應產生羥基磷灰石和水，水促進硅酸鈣水化反應生成C-S-H和氫氧化鈣，在細胞容相性、組織相容性等方面均具有與MTA相當的良好生物相容性[17-18]。根管充填后尤其是在患牙根尖部狹窄區受到炎性破壞的情況下，極佳的流動性使得iRoot?SP容易超出根尖孔與根尖周組織長期接觸，但iRoot?SP超充對患牙的愈合無明顯影響[19]，其良好的生物相容性有利于根尖周組織的健康。HiFlow與iRoot?SP的主要成分相同，僅粒度分布不同；與iRoot?SP相比在加熱時表現出較低的粘度，且具有更好的X線阻射性，使其更適合用于熱牙膠垂直加壓充填法，加熱溫度150～220 ℃；Brasseler USA公司稱其具有良好的生物相容性、與羥基磷灰石粘接性能、低收縮性、抗菌性、X線阻射性。由本實驗可見HiFlow對L929細胞的細胞毒性作用與MTA、 iRoot?SP類似，其差異無統計學意義；小于AH Plus，其差異有統計學意義，認為可臨床用于根管充填。臨床廣泛應用還需進一步的臨床應用加以驗證。