植入不同皮質骨厚度區域微種植體骨整合的組織形態學和生物力學研究

吳也可 趙立星 郜然然

微種植體被常規用于支抗加強,盡管微種植體在正畸治療結束后就去除，但微種植體因植體斷裂或松動造成的失敗率為0%～30%[1]。微種植體的初期穩定性即植入后的即刻穩定性，主要由微種植體周圍皮質骨的質和量決定。二期穩定性，指骨和微種植體接觸界面骨的狀況，由骨整合(osseointegration，OI)獲得。良好的初期穩定性是獲得較高二期穩定性和存活率的基礎。

近期，學者們關注不同根間區域的皮質骨厚度(cortical bone thickness，CBT)，并提出微種植體植入最佳位點的臨床指南[2-4]。骨的質和量對于正畸微種植體的初期穩定性乃至長期成功率至關重要[5]。研究者證實CBT值與微種植體成功率呈正相關，提示1 mm為改善微種植體成功率的臨床CBT閾值[6]。作者前期研究表明，植入較厚CBT區域比植入較薄者的無應力載荷的微種植體在愈合早期具有更高穩定性[7]。上頜骨比下頜骨具有相對較薄的皮質骨。相關研究亦表明植入下頜骨的微種植體初期穩定性和成功率比上頜骨更高[8]。然而，一些人體和動物實驗報道卻得出相反結論[9]。作者也發現植入后7 周，上頜骨比下頜骨能獲得更高的OI和穩定性[10]。基于臨床經驗和本課題組前期研究，猜想在不同CBT組微種植體的穩定性和OI值顯著不同。

綜上，本研究擬運用Micro-CT、拉拔試驗和多重熒光序列標記法探討不同愈合時間CBT對應力加載下正畸微種植體穩定性和OI的影響。

1 材料與方法

1.1 動物分組及微種植體植入

將48枚微種植體(長度6 mm，直徑1.6 mm，Medicon公司，德國)植入12 只成熟骨齡Beagle犬(23 月齡，平均體質量11.7 kg)兩側脛骨，每個脛骨2 枚。動物由四川大學實驗動物中心提供，均健康。本研究所有動物實驗均經過四川大學實驗動物倫理委員會批準。所有動物均經過系統和局部麻醉。鈍性分離暴露脛骨骨面，切口遠離術區，在脛骨近端干骺端植入2 枚微種植體，均在脛骨粗隆下方，分別距離干骺端2 cm和4 cm。CBT從脛骨末端到中心逐漸增加，即每個脛骨上的2 枚微種植體分別植入距干骺端2 cm處(薄CBT組，n=24)和距干骺端4 cm處皮質骨區域(厚CBT組,n=24)(圖 1A)。植入術后即刻于干骺端一側2 枚微種植體間安置鎳鈦螺旋拉簧，加載2 N的力(圖 1B)。微種植體植入后1、3、5、7 周處死動物。

A: 2 枚微種植體植入脛骨近端干骺端的脛骨粗隆側； B: 植入后，在2 個微種植體間用鎳鈦螺旋拉簧加載2 N應力

為評估微種植體植入后的骨重塑，用序列染色：植入后1 周，靜脈注射四環素(20 mg)，3周靜注鈣黃綠素(8 mg)，5 周靜注二甲苯橙(120 mg)。

1.2 檢測樣本制備

用過量戊巴比妥鈉處死動物，取下帶微種植體的脛骨，用渦輪機將標本修整成組織塊，要求每個組織塊包含一枚種植釘和其周圍至少5 mm不含軟組織的骨質。用游標卡尺測量每個骨塊上方近中端和遠中端的皮質骨厚度。經多重熒光序列染色的標本用5%戊二醛固定1 周，梯度酒精和氯仿輪流脫水，然后用聚甲基丙烯酸甲酯包埋。用顯微薄片切片機(SP 1600，Leica公司,德國)低速(0.4 mm/min)將包埋的骨樣本沿與微種植體長軸平行方向切片。其他骨/微種植體塊用10%福爾馬林溶液4 ℃固定。

1.3 Micro-CT檢測

樣本固定2 周后，按照以前報道方案進行Micro-CT(CT80,Scanco Medical公司,瑞士)檢測[11]。計算以下形態學參數：松質骨體積密度(骨體積/總體積)(BV/TV)，相交表面(與微種植體接觸的骨表面)(IS)。微種植體的骨整合(OI)由IS與骨內微種植體表面積的比值計算而來。

1.4 生物力學拉拔試驗

Micro-CT分析以后，在材料測試系統(Instron 5565，Instron公司,美國)上進行拉拔試驗(圖 2)[11]。監測施加應力及拉拔峰值載荷(Fmax)。

1.5 熒光顯微觀察和組織形態學分析

對多重熒光序列染色的樣本，沿微種植體長軸切制200 μm厚硬組織切片。選取最接近長軸中點的3 張切片(共144 張)，在熒光顯微鏡(IX71；Olypus公司,日本)下觀察骨。用裝有圖形分析系統(Image-Pro Plus，Media Cybernetics公司,美國)的熒光顯微鏡拍攝顯微圖片，對愈合期間沉積于微種植體兩側的四環素、鈣黃綠素和二甲苯橙進行定量分析。

1.6 統計學分析

采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析。用方差分析比較組間組織形態學和生物力學參數差異，不同時間點薄CBT和厚CBT組的均值用SNK-t檢驗進行比較。P<0.05具有統計學意義。

2 結 果

2.1 種植體植入成功率及相關影像

各組微種植體植入成功率為100%，所有微種植體在整個實驗過程中均保持穩定，未見松動脫落。在各時間點，2 種植入位點的CBT差異均具有統計學意義(P<0.05，表 1)。顯微CT的高分辨率斷層圖像清晰顯示了骨-種植體界面，確定了與種植體相接觸的骨組織并量化了OI，并且觀察到微種植體周圍皮質骨和松質骨內骨小梁有不同程度的吸收(圖 3～4)。

2.2 生物力學相關指標

圖 2 測試儀器 圖 3 顯微CT分析儀三維重建

圖 4 微種植體周圍松質骨：含有中等松質骨體積密度值的代表性樣本

表 1 微種植體植入位點的皮質骨厚度

植入后1 周，薄CBT組OI、BV/TV、IS和Fmax4 個指標均較厚CBT組低(P<0.05)。薄CBT組OI值為22.64%，厚CBT組為38.73%。拉拔試驗結果顯示，薄CBT組Fmax為261.27 N，厚CBT組為373.35 N(P<0.05)。植入后1～3 周，薄CBT組3個形態學指標顯著增加(P<0.05)，Fmax略有增加(P>0.05)。而在厚CBT組，上述4個指標均顯著降低(P<0.05)。植入后3周，厚CBT組所有指標仍顯著高于薄CBT組(P<0.05);植入后5 周，隨愈合時間延長，薄CBT組形態學指標持續上升，開始顯著高于厚CBT組(P<0.05)。厚CBT組Fmax開始略有增加，但第5周和第3周相比差異無統計學意義(P>0.05)。薄CBT組生物力學指標仍低于厚CBT組(P<0.05)。植入后7 周，厚和薄CBT組4個指標均較第5周有所提升。其中薄CBT組差異具有統計學意義，厚CBT組差異無統計學意義(P>0.05)。2 組間相比，厚CBT組的值仍高于薄CBT組，但差異無統計學意義(P>0.05)。這些檢測指標總體變化趨勢呈時間依賴性(圖 5)。

2.3 骨重塑及骨整合

熒光顯微鏡分析結果表明在所有骨/微種植體切片均有明顯骨重塑和骨整合。新形成的骨被多重熒光序列染色標記，鈣黃綠素為較窄綠線，二甲苯橙為紅色條帶，四環素為彌散黃染形式。松質骨較皮質骨能更明顯觀察到多重熒光序列染色。在松質骨的部分區域，二級骨單位表現為松質骨周圍同心圓狀沉積的標記物(圖 6)。在薄CBT組微種植體兩側能見到比厚CBT組更多的骨重塑。

表 2顯示3 條最好的種植體螺紋內不同位點3 種熒光標記的沉積面積測量結果。薄CBT組壓力側值最大，而厚CBT組張力側值最小。方差分析表明薄CBT組顯著高于厚CBT組(P<0.05)。薄CBT組2 個表面的鈣黃綠素沉積量均顯著高于二甲苯橙和四環素(P<0.05)。在厚CBT組，四環素沉積面積顯著低于其余2 種標記(P<0.05)，但鈣黃綠素和四環素間差異無統計學意義(P>0.05)。

圖 6 骨重塑和骨整合(熒光顯微鏡，×100)

表 2 多重熒光序列標記的沉積面積

Tab 2 Deposition area of the polyfluorochrome sequential labeling (mm2,

表 2 多重熒光序列標記的沉積面積

標記沉積面積壓力側張力側四環素鈣黃綠素二甲苯橙四環素鈣黃綠素二甲苯橙薄CBT組29.71±0.92188.23±12.79104.96±7.722.47±0.2282.56±4.1290.31±6.04厚CBT組10.55±1.16113.15±9.5276.21±4.541.68±0.1455.70±4.6364.47±5.91

3 討 論

由于微種植體解剖學限制較小，可根據正畸治療的需要選擇上頜骨或下頜骨很多位點植入，比如顴牙槽嵴、下頜骨外斜線、牙間/根間區以及前后牙槽突[12]。這些植入位點的CBT隨解剖結構不同而異。脛骨具備規則的外形、皮/松質骨分界清楚、從干骺端到骨中段皮質骨厚度逐漸增加等典型長骨的解剖學特點，分別選擇鄰近脛骨干骺端和毗鄰脛骨中段的區域作為薄和厚CBT組植入位點，并在不同CBT位點2個微種植體之間即刻加載2 N的應力。這樣排除了復雜口腔環境等干擾因素的影響，以便精準探討不同CBT對應力加載下微種植體穩定性的作用。

本研究綜合運用了顯微CT、拉拔試驗和多重熒光序列標記實驗來衡量植入2 個不同CBT位點微種植體的穩定性。其中，顯微CT掃描顯示了骨和種植體界面的三維高分辨形態學信息，比傳統組織形態學分析提供了更精確的數據。然而，當界面有新的骨和軟骨形成時，顯微CT難以顯示類骨質，計算所得OI值可能比實際偏低。因此，尚需生物力學拉拔試驗檢測微種植體的固位力以驗證顯微CT參數。另外，為了更好理解微種植體周圍的骨重塑情況，本研究還參考Lopes等[13]報道的方案進行了多重熒光序列標記實驗。綜合以上實驗結果，總結出以下幾點：①植入后3周是骨重塑的關鍵階段；②在不同階段皮質骨形成顯著少于松質骨，提示皮質骨骨重塑活性相對較低；③薄CBT組松質骨形成顯著多于厚CBT組，其機制可能是較薄皮質骨相對更有利于機械應力傳導進入其下松質骨，且薄CBT組密集分布呈編織狀結構的松質骨可能也有利于更多新骨形成；④微種植體壓力側骨形成顯著多于張力側，更提示機械應力正性調控骨重塑。

本研究發現植入較厚皮質骨的微種植體獲得了更高的初期穩定性，與很多研究結果一致[6-8]。推測原因如下：①薄CBT區域松質骨分布越密集，熒光標記顯示骨礦化越好，越有利于獲得高的二期穩定性；②微種植體植入皮質骨造成的損傷，因較差的血供和較低的再生能力，導致厚CBT組植入后OI%和Fmax有所降低；③厚CBT區域的形變能力較薄CBT更弱，導致對骨重塑很重要的機械應力難以傳導進入其下的松質骨。研究結果提示正畸微種植體對初期穩定性的要求并不高，與之前牙科種植體的觀點相悖。原因可能是牙科種植體承受各方向較大應力，而正畸微種植體僅負荷單一方向較小的力，過高的初期穩定性并非必要。鑒于正畸牙移動的適宜力值為0.3～4 N，遠低于本研究采用的拉拔力，建議微種植體在任何治療階段均可負載正畸施力強度(0.3～4 N)[14]。正畸臨床使用臨時性支抗裝置，最主要考慮的是植入部位應選擇有充足松質骨量、血供豐富的解剖安全區域[15]。

4 結 論

厚皮質骨區域植入的微種植體具有更高的初期穩定性，薄皮質骨區域的微種植體隨時間延長穩定性顯著增加，后期二者差異無統計學意義。考量植入局部的骨條件，采用適宜的加載方式對成功治療至關重要。