咬合干擾致大鼠咬肌損傷及相關(guān)標(biāo)志物的研究

楊祖閣 張趙一淳 任昊喆 王若欣 于世賓 張婧

顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病是口腔臨床的常見病，可累及咀嚼肌、顳下頜關(guān)節(jié)及周圍組織[1]，咀嚼肌酸困、疼痛和功能障礙是其主要癥狀之一。盡管顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病的致病因素眾多，咬合因素在其中一直備受關(guān)注[2]。已有臨床實驗證實咬合異常患者的咀嚼肌對疼痛更加敏感且肌電活動明顯改變[3-4]。動物實驗也證實異常咬合可導(dǎo)致咀嚼肌疼痛閾值顯著降低[5-6]，該課題組前期研究發(fā)現(xiàn)異常咬合可以造成大鼠咀嚼肌超微結(jié)構(gòu)改變[7]。

本實驗旨在全面評價實驗性牙齒移動引起的咬合干擾造成咀嚼肌損傷的程度，觀察咬肌的組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)變化，及骨骼肌損傷標(biāo)志物結(jié)蛋白(desmin)和骨骼肌肌鈣蛋白抑制亞基(skeletal muscle troponin I,sTnI)蛋白的表達和血清中肌酸激酶(creatine kinase,CK)、 乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)和肌紅蛋白(myoglobin,Mb)含量的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供54 只8 周齡SD雌性大鼠(體重200～220 g)，隨機平均分為對照組(Con)、咬合干擾組(Exp)、咬合干擾+EDTA注射組(Exp+EDTA)(n=18)。

咬合干擾組大鼠，腹腔注射1%的戊巴比妥鈉(Sigma,美國)進行麻醉，在左側(cè)上頜第二、第三磨牙之間，及右側(cè)下頜第二、第三磨牙之間塞入正畸皮圈(1/8，3M，美國)，以第一、第二磨牙為支抗，以皮筋的膨脹力向遠中推第三磨牙移動約半個牙尖的距離(約0.8 mm)，改變雙側(cè)上下第三磨牙之間的咬合關(guān)系，確保皮筋不脫落不高于咬合平面，保持該間隙直到實驗結(jié)束。對照組大鼠，將皮圈塞入后立即取出，其余實驗方法同咬合干擾組。Exp+EDTA注射組大鼠，在分牙操作前將Ca2+螯合劑EDTA-Na2(90 mg/kg，Sigma，美國)溶于0.4 ml的生理鹽水中，雙側(cè)咬肌皮下各注射0.2 ml，實驗期間每天注射1 次。

1.2 取材和樣本制備

實驗后1、2、4 周分別將Con組、Exp組、Exp+EDTA注射組(每個時間點n=6)大鼠以1%的戊巴比妥鈉腹腔注射深度麻醉，取腹主動脈血后處死，快速取雙側(cè)咬肌。取其中3 只大鼠雙側(cè)咬肌前中部組織，4 ℃條件下固定，脫水，石蠟包埋，切片(厚約5 μm)，蘇木素-伊紅染色(n=3)；取雙側(cè)咬肌后部組織，修整，4%戊二醛和1%四氧化鋨分別固定2 h，丙酮梯度脫水，包埋，超薄切片后以透射電鏡(JEOL，日本)觀察(n=3)。取其余3 只大鼠雙側(cè)咬肌前中部組織，4 ℃條件下勻漿，加入緩沖液和溴酚藍，80 ℃加熱5 min變性，待Western blot檢測；取雙側(cè)咬肌后部組織，4 ℃條件下進行勻漿，待線粒體內(nèi)Ca2+含量檢測。

1.3 線粒體內(nèi)Ca2+含量檢測

在4 ℃條件下，以組織線粒體分離試劑盒(碧云天，中國)提取咬肌線粒體，原子吸收分光光度計(日立，日本)檢測Ca2+含量，BCA法進行線粒體蛋白定量，計算線粒體內(nèi)Ca2+含量(n=3)。

1.4 Western blot檢測

采用SDS-不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)、12% Laemmli分離膠電泳，以半干電轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad，美國)15 V轉(zhuǎn)膜15 min，1%BSA+TBS封閉30 min，4 ℃一抗過夜(desmin和actin，Sigma，美國；sTnI抗體為第四軍醫(yī)大學(xué)航空航天醫(yī)學(xué)系余志斌教授所贈[8])，耦聯(lián)紅外熒光二抗孵育1 h，Odyssey紅外線掃描儀(Li-Cor,美國)掃描成像(n=3)。

1.5 血清學(xué)檢測

動脈血室溫靜置1 h，4 ℃過夜，在4 ℃條件下4 000 r/min離心10 min，取上清液分裝。以全自動生化儀(Roche，瑞士)檢測大鼠血清中CK、LDH的含量，以ELISA試劑盒(ADL)檢測血清中Mb含量(n=6)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 組織學(xué)變化

Con組大鼠咬肌組織形態(tài)正常，肌纖維橫截面為圓形或多角形，細(xì)胞核位于邊緣。各時間點咬合干擾組肌纖維形態(tài)基本同對照組，無明顯炎性表現(xiàn)(圖 1)。

2.2 超微結(jié)構(gòu)改變

Con組大鼠咬肌肌原纖維排列整齊，線粒體大小均勻，排列整齊，嵴較多。Exp組肌纖維的部分線粒體變大變圓，基質(zhì)電子密度降低，嵴斷裂變短變少，甚至消失，未見肌原纖維排列紊亂，左右側(cè)無明顯差異。Exp+EDTA阻斷細(xì)胞內(nèi)Ca2+后，可見咬肌細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)基本正常(圖 2)。

2.3 線粒體內(nèi)Ca2+含量變化

各組大鼠左右兩側(cè)咬肌線粒體Ca2+含量無明顯差異(P=0.282)，各時間點Exp組線粒體內(nèi)的Ca2+含量明顯高于對照組(P<0.05)，而注射Ca2+阻斷劑后，線粒體內(nèi)Ca2+含量回落到Con組水平(P>0.05)(圖3)。

2.4 骨骼肌損傷標(biāo)志物檢測

各時間點Exp組大鼠咬肌內(nèi)的骨骼肌損傷標(biāo)志物desmin和sTnI在各個時間點的表達均沒有明顯變化(圖 4)，Exp組大鼠血清中CK、LDH和Mb與Con組間均無明顯差異(圖 5)。

圖 1 大鼠咬肌組織切片HE染色

圖 2 透射電鏡觀察大鼠咬肌超微結(jié)構(gòu)(×10 000)

圖 3 大鼠咬肌線粒體Ca2+含量

3 討 論

目前，在骨骼肌運動損傷的相關(guān)研究中Ca2+環(huán)境失調(diào)理論是主要機制之一，骨骼肌處于不適應(yīng)的運動狀態(tài)下，細(xì)胞膜上的牽張性陽離子通道開放，Ca2+內(nèi)流導(dǎo)致肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量增加，線粒體不僅為細(xì)胞提供能量，還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載時，線粒體便會攝入Ca2+，維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+的平衡。但是當(dāng)線粒體內(nèi)Ca2+過多時，便會影響線粒體的功能，破壞其形態(tài)，最終影響肌細(xì)胞的功能[9-10]。

圖 4 大鼠咬肌中desmin 和sTnI的含量

圖 5 大鼠血清中肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌紅蛋白(Mb)含量

有研究表明，加高/降低動物咬合使得咬肌細(xì)胞及其線粒體內(nèi)Ca2+含量增加，并出現(xiàn)骨骼肌損傷特征性表現(xiàn)，如紅細(xì)胞滲出、白細(xì)胞浸潤等組織學(xué)炎性變現(xiàn)，及線粒體腫脹、肌漿網(wǎng)空泡性變、肌纖維排列紊亂等超微結(jié)構(gòu)的變化。Akagawa等[11]加高Wistar大鼠垂直咬合距離，觀察到咬肌及顳肌前束出現(xiàn)組織學(xué)改變，以咬肌深層為重。祁冬等[12]在兔單側(cè)前磨牙粘固咬合板造成咬合創(chuàng)傷，10 d后觀察咬肌組織的超微結(jié)構(gòu)和線粒體鈣離子含量，發(fā)現(xiàn)單純咬合創(chuàng)傷組出現(xiàn)明顯的肌肉損傷改變，肌原纖維排列疏松，線粒體腫脹以及線粒體鈣離子含量明顯增加等表現(xiàn)。Bani等[13]降低大鼠單側(cè)咬合后，觀察到大鼠實驗側(cè)咬肌出現(xiàn)廣泛的線粒體腫脹等超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)，并且肌組織內(nèi)鈣離子含量明顯增加。而給予Ca2+阻斷劑后，可以抑制細(xì)胞和線粒體內(nèi)Ca2+超載，并緩解超微結(jié)構(gòu)損傷[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，與加高動物咬合的實驗結(jié)果不同，實驗性牙移動引起的咬合干擾未引起大鼠咬肌組織學(xué)改變，但可以引起超微結(jié)構(gòu)的改變，如部分線粒體形態(tài)變大變圓，嵴等特征性結(jié)構(gòu)消失，咬肌細(xì)胞線粒體內(nèi)Ca2+含量的明顯增加，且注射Ca2+阻斷劑可明顯緩解超微結(jié)構(gòu)損傷。

近來研究認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)Desmin和sTnI丟失是骨骼肌運動損傷的敏感指標(biāo)[15-16]。Desmin是一種中間絲蛋白，是構(gòu)成脊椎動物骨骼肌、心肌和平滑肌細(xì)胞骨架的主要成份，連接于Z線之間，限制肌節(jié)在肌肉收縮時被過分牽拉。有研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)運動可導(dǎo)致肌細(xì)胞中desmin斷裂[17]， 而細(xì)胞骨架蛋白的破壞可導(dǎo)致超微結(jié)構(gòu)。肌鈣蛋白(troponin,Tn)屬于橫紋肌結(jié)構(gòu)蛋白，由C、T、I 3 種亞基組成，骨骼肌肌鈣蛋白抑制亞基(sTnI)，是肌鈣蛋白I的一種亞型，參與調(diào)節(jié)橫紋肌收縮。sTnI在骨骼肌細(xì)胞中主要以結(jié)構(gòu)蛋白的形式結(jié)合在肌原纖維上，當(dāng)骨骼肌發(fā)生損傷后，sTnI與肌原纖維解離，進入血循環(huán)中[18]。本研究中未見肌組織中sTnI和desmin明顯丟失，與電鏡觀察結(jié)果中超微結(jié)構(gòu)損傷僅局限于線粒體形態(tài)改變，未見肌原纖維排列紊亂相印證。

肌酸激酶(CK)存在于肌肉和腦等組織的線粒體和細(xì)胞漿中，與肌細(xì)胞中能量運轉(zhuǎn)和ATP再生有關(guān)；乳酸脫氫酶(LDH)廣泛存在全身各組織中，特別是肌組織，與細(xì)胞內(nèi)無氧糖酵解有關(guān)；肌紅蛋白(Mb)僅存在于心肌與骨骼肌中。正常情況下，這3 種物質(zhì)在血清中的含量非常低，但如果肌細(xì)胞發(fā)生損傷，細(xì)胞膜破裂，這3 種物質(zhì)便會進入血液。大量研究表明，骨骼肌損傷即刻出現(xiàn)血中CK、LDH、Mb活性明顯升高[19-20]。咬合干擾組大鼠的血清中未見CK、LDH和Mb含量升高，提示實驗性牙移動形成的咬合干擾并不會造成咬肌細(xì)胞胞膜破裂的嚴(yán)重?fù)p傷。

綜上，實驗性牙移動形成的咬合干擾可造成大鼠咬肌輕微損傷，主要表現(xiàn)為超微結(jié)構(gòu)變化，且與細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)有關(guān)。