基于網絡藥理學探討乳積方治療三陰性乳腺癌的作用機理

戴黎穎， 陳學彰， 李宏良， 陳錫康， 田華琴

廣州中醫藥大學附屬佛山中醫院腫瘤中心，廣東 佛山 528000

三陰性乳腺癌(Triple negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體2均為陰性表達的乳腺癌，易發生術后轉移，惡性程度高，預后差。而中醫藥在乳腺癌的治療上有獨特的優勢，如改善生活質量，降低毒副反應以及增強療效等作用[1]。乳積方(北柴胡、白芍、黨參、山慈菇、海藻、瓜蔞、浙貝母、預知子，王不留行）是廣州中醫藥大學附屬佛山中醫院腫瘤中心用以治療乳腺癌的經驗方。整張方著眼于乳腺癌肝郁氣滯、痰毒蘊結的病機特點，從疏肝健脾，清熱散結角度進行處方布局。方中柴胡疏肝理氣、升舉陽氣，為君藥；配伍白芍合養血柔肝，黨參補益肺脾，扶助正氣，為臣藥；浙貝母、山慈菇、海藻，化痰散結；瓜蔞清熱滌痰開胸，預知子疏肝理氣、活血止痛；王不留行活血通經，是為佐藥[2]。前期研究發現，乳積方制劑對人乳MDA-MB-231細胞具有增殖抑制作用，能增效減毒以及降低乳腺癌術后復發、轉移率[3-7]，但乳積方治療TNBC的作用機制還有待深入研究。

本研究使用網絡藥理學方法提取、分析乳積方成分、作用靶點和分子通路等，進而探討乳積方治療TNBC可能的機制，為研究其作用機制的相關實驗研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 乳積方主要化學成分收集

利用中藥系統藥理學分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索乳積方9味中藥的化學成分。設定各中藥生物利用度(bioavailability，OB）≥30%，類藥性(drug-likeness，DL）≥0.18。篩選出各藥物有效成分(ingredients），并根據篩選出來的有效成分過濾其對應的靶基因(Related Targets）。

通用蛋白資源(Universal Protein Resource，UniProt，https：//www.uniprot.org）是一個高數據量、高質量的蛋白質序列與功能信息數據庫，可將TCMSP中獲取的藥物靶基因名稱轉化為UniProt數據庫中基因所對應的名稱。

1.2 TNBC疾病靶點的篩選

使用在線人類孟德爾遺傳數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man， OMIM， http：//omim.org）、Gencards數據庫(http：//www.genecards.org）檢索“TNBC”以及“Triple negative breast cancer”，獲取TNBC疾病基因。

1.3 藥物-活性成分-疾病相互作用網絡構建

使用R軟件“VennDiagram”程序包，取乳積方藥物靶基因和疾病靶點的交集，繪制韋恩圖；使用Cytoscape(Version3.7.2）制作TNBC-乳積方-活性成分-作用靶點網絡。

1.4 構建乳積方-TNBC交集靶點蛋白互作網絡

STRING數據庫(https：//string-db.org）是一個基因、蛋白質相互作用關系的檢索網。將乳積方和TNBC交集基因導入到檢索框中，選擇“homo sapines”進行分析。設定P＜0.05作為篩選條件，設置“隱藏游離點”、交互分數最低值為0.9，得到蛋白互作網絡(protein protein interaction network，PPI network）分析結果。下載該TSV文件，對PPI網絡中交集靶點度值進行統計，遴選出該網絡的核心基因。

1.5 基因本體論(GO）分析和KEGG通路富集分析

Bioconductor(https：//www.bioconductor.org）是一個分析分子生物學實驗產生的基因組數據的軟件。京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia ofGenesandGenomes， KEGG， https：//www.genome.jp/kegg/）是一個綜合數據庫，整合了基因組信息、化學信息和生化系統功能信息，其通路數據子數據庫(PATHWAY）記錄的是細胞分子相互作用網絡以及具體生物所特有的變化形式。

從Bioconductor下載R語言的相應程序包[8，9]，使用R軟件進行GO分析和KEGG通路富集分析。

2 結果

2.1 乳積方中活性成分及靶點的獲取和篩選

通過TCMSP數據庫檢索，篩選出活性成分柴胡17個，白芍13個，黨參21個，山慈菇3個，瓜蔞11個，浙貝母7個，海藻4個，預知子6個，王不留行4個，共計86個，排除重復成分后，整理如表1。

表1 乳積方中有效成分信息Table 1 Information of effective ingredients in Rujifang

（續表1）

根據活性成分結果，從TCMSP下載相應活性對應的靶點數據，共檢索到藥物靶點柴胡349個，白芍112個，黨參214個，山慈菇29個，瓜蔞35個，浙貝母70個，海藻174個，預知子44個，王不留行193個。將上述靶點在Uniprot數據庫進行比對，共取得靶點196個。

2.2 乳積方治療TNBC的潛在靶點預測

使用GeneCards及OMIM進行TNBC相關基因篩選，共獲得基因靶點3 751個，排除重復基因靶點，共收集到3 724個；使用R軟件(3.6.1）VennDiagram包繪制藥物活性成分靶點與TNBC疾病靶點的韋恩圖，結果如圖1，共有156個基因重疊。

圖1 乳積方藥物靶點與TNBC疾病靶點交集韋恩圖（藍色圓框為疾病靶點，紅色圓框為藥物靶點）Figure 1 Venn diagram of Rujifang drug targets and TNBC disease targets（The blue circle means the Disease target and the red circle means the Drug target）

2.3 疾病-方劑-藥物有效成分-作用靶點的網絡構建及分析

使用Cytoscape軟件構建疾病-方劑-藥物有效成分-作用靶點網絡。將乳積方86個分子有效成分和156個關鍵基因導入Cytoscape，如圖2所示。在乳積方-作用靶點的網絡中，有效成分quercetin(槲皮素）度值最高，達708，如表2。基因NCOA2表達度值最高，達39，如表3。

2.4 蛋白互作網絡(PPI網絡）構建

圖2 TNBC-乳積方-藥物有效成分-作用靶點網絡圖（紫色方框為作用靶點，淡紅色菱形為有效成分）Figure 2 Network of TNBC-Rujifang-effective ingredients-action targets （purple box means action targets，light red diamond means effective ingredients）

表2 Cytoscape網絡中疾病關鍵靶基因度值前5位的乳積方有效成分Table 2 The effective ingredients of Rujifang in the top 5 of the target gene degree in Cytoscape network

將上述156個重疊基因導入STRING數據庫獲取蛋白質，得到交互文件，得到圖3。下載TSV文件，統計度值前20位基因靶點，繪制柱狀圖，如圖4，縱坐標為基因名，橫坐標表示其度值，最大的JUN度值為34，其次為MAPK1、AKT1、RELA、IL6、 MAPK8、 APP、 ESR1、 MAPK14、 CXCL8。上述蛋白在PPI網絡中具有重要地位，是乳積方治療TNBC的關鍵基因。度值越大，代表其為核心基因的可能性最大。

2.5 關鍵靶點基因生物功能及通路分析

GO分析提示，乳積方的80個關鍵靶點基因主要的生物學功能有protein heterodimerization activity(蛋白異源二聚體作用），proximal promoter sequence-specific DNA binding(近端啟動子序列特異性DNA結合），RNA polymeraseⅡproximal promoter sequence-specific DNA binding(RNA聚合酶Ⅱ近端啟動子序列特異性DNA結合）和chromatin binding(染色質綁定）。說明乳積方治療TNBC可以通過上述生物學功能參與多種生物調控而發揮作用。

表3 Cytoscape網絡中乳積方有效成分度值前8位的TNBC基因Table 3 TNBC gene in the top 8 of effective ingredients of Rujifang in Cytoscape network

圖3 乳積方與TNBC重疊靶點基因的PPI網絡Figure 3 PPI network of overlapping target genes of Rujifang and TNBC

圖4 PPI網絡中靶點基因度值前20位Figure 4 Top 20 in PPI network of target genes degree

2.6 KEGG通路富集分析

KEGG通路富集結果顯示，乳積方治療TNBC的關鍵基因靶點主要富集的通路有：PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路、Apoptosis信號通路、細胞凋亡信號通路。并且與乙型肝炎、人類巨細胞病毒感染、卡波氏肉瘤相關皰疹病毒感染，癌癥的蛋白聚糖和動脈粥樣硬化的MicroRNAs上調、下調有相關性，如圖6、表4。

3 討論

本研究結果顯示乳積方中槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇和木犀草素度值大，說明上述成分在乳積方治療TNBC中發揮了重要作用，其中槲皮素、山柰酚均為黃酮類化合物。槲皮素在柴胡中的量高達4.708 1 mg/g。山奈酚為白芍重要的有效成分，臨床中柴胡、白芍經常作為藥對使用以疏肝解郁。在一項對黃酮類化合物的藥理研究中發現，其具有抗抑郁、抗腫瘤等藥理活性[10，11]。這和乳腺癌病因病機中的“情志內傷”、“沖任失調”相呼應[12]。近年來研究發現槲皮素能誘導包括雌激素受體陽性乳腺癌細胞在內的9種腫瘤細胞系的細胞凋亡，使小鼠的腫瘤體積顯著減少[13]。低劑量的山奈酚能通過阻斷RhoA和Rac1信號通路，抑制TNBC細胞的轉移和侵襲[14]。β-谷甾醇是山慈菇的主要有效成分，其對乳腺癌細胞具有較強的抗增殖活性[15]。木犀草素能降低乳腺癌細胞株的活力，加速細胞凋亡，提高miR-203的表達，而miR-203的表達與木犀草素的抗腫瘤作用呈正相關[16]。

圖5 關鍵靶點生物學功能富集圖Figure 5 Enrichment diagram of biological functions of key targets

表4 KEGG富集結果計數前5位Table 4 Top 5 of KEGG enrichment result

蛋白互助網絡顯示JUN、MAPK1、AKT1、RELA、IL6、MAPK8等靶點基因度值大，說明其在乳積方治療TNBC機制中有重要作用。JUN屬轉錄因子AP-1的亞家族，參與基因調節，促進細胞增殖[17]。在體外實驗中，JUN表達可以促進新生小鼠的肝臟體積增長[18]。本研究GO分析提示，JUN可能通過蛋白異源二聚體和近端啟動子序列特異性DNA結合發揮作用；AKT1屬于AKT家族，同時AKT也是屬于PI3K/Akt信號通路的節點分子，在乳腺腫瘤中以異常活化形式存在，促進腫瘤細胞的生長及增殖。一些針對AKT的小分子抑制劑，如Afuresertib、AZD5363、MK2206已作為抗癌藥進入到臨床試驗階段[19]。活化的AKT可以調節一系列與細胞增殖相關的蛋白，如P65(即RELA），從而參與腫瘤的侵襲轉移[20]。RELA屬于NF-κB家族，其激活與惡性腫瘤的發展呈正相關。IL6在晚期癌癥中通常屬于高表達，通過上調PIM1促進乳腺癌細胞的侵襲[21，22]。MAP激酶是多種生化信號的整合點，參與多種細胞過程如增殖、分化、轉錄調控和發育等[23]。上述研究報道與本研究結果相符。

圖6 KEGG富集通路氣泡圖Figure 6 Bubble diagram of KEGG enrichment pathway

PI3K/Akt信號通路為本研究發掘出的乳積方治療TNBC最重要通路。有效成分β-谷甾醇可通過調節PI3K通路參與抗癌，核心靶點AKT1屬于PI3K/Akt信號通路的節點分子，KEGG富集結果也提示PI3K-Akt信號通路出現頻次最高。由此可見PI3K通路是乳積方治療TNBC的一條重要通路。其可由不同細胞刺激物或毒素激活，參與腫瘤的增殖、分化、凋亡等過程，也能通過VEGF等相互作用，促進腫瘤血管新生；與下游CCND1相互作用，干擾細胞周期；與其下游的MAPK相作用，可導致細胞增殖[24，25]。PI3K/Akt通路在中醫藥治療乳腺癌領域的研究尚少，主要集中在HER-2陽性乳腺癌，均為單藥或者復方對該通路的下調作用研究[26-28]。

綜上，本研究應用網絡藥理學方法，對乳積方有效成分、相關靶點、疾病蛋白和作用通路等進行梳理，發現乳積方治療TNBC機制為多成分、多靶點、多通路的協同作用。由于數據庫的完整性、數據篩選的規范性不統一，所以本研究結果僅作為參考，為下一步基礎實驗提供一個可能的方向。