復方黃芪金銀花顆粒的質量標準研究

翟少欽，曹國文，李成君

(重慶市畜牧科學院獸醫研究所，重慶 402460)

復方黃芪金銀花顆粒是重慶市畜牧科學院獸醫研究所根據中醫理論研制的治療雞傳染性法氏囊病的中藥復方制劑。為更好地控制其在生產過程中的質量，對復方黃芪金銀花顆粒進行了質量標準的研究，以期為復方黃芪金銀花顆粒投入生產進行質量控制提供依據。

1 儀器、對照品及化學試劑

1.1 儀器 超聲波清洗機:KQ－3200E型，昆山超聲波儀器有限公司;三用紫外儀:ZF－2型，上海安亭電子儀器廠;電子天平:BS25S型，德國賽多利斯儀器有限公司，d=0.01 mg;雙光束紫外可見分光光度計:TU－1901型，北京普析通用儀器有限公司;硅膠 G、H板:青島海洋化工廠分廠，批號20100201、20091211。

1.2 對照品 齊墩果酸對照品:A0117，純度≥98%(滴定法);綠原酸對照品:A0022，純度≥98%(HPLC);女貞子對照藥材:121041－200302;枸杞子對照藥材:121072－200806;黃芪甲苷對照品:A0070，純度≥98%(HPLC)。均購自中國藥品生物制品檢定所。

1.3 試劑 所有化學試劑均為分析純。

2 試驗方法

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 女貞子 取本品5 g，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，冷卻，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇－三氯甲烷(3∶2)混合溶液1 mL使溶解，作為供試品溶液。取缺失女貞子的顆粒，同法制成陰性對照溶液。另取齊墩果酸對照品，加乙醇制成1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取供試品溶液3～5 μL、對照品溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷－丙酮－乙酸乙酯(5∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在110℃加熱至斑點顯色清晰。置紫外光燈(365 nm)下檢視，記錄結果。供試品色譜中，在與對照品色譜相應位置上，顯相同顏色的斑點［1－3］(圖1)。

圖1 女貞子薄層鑒別圖

2.1.2 枸杞子 取本品6.0 g，研細，加水100 mL，超聲40 min，放冷，過濾，取濾液，用乙酸乙酯50 mL提取，分取乙酸乙酯，蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。取枸杞子對照藥材1 g，加水50 mL，超聲30 min，放冷，過濾，取濾液，用乙酸乙酯30 mL振搖提取。分取乙酸乙酯溶液，蒸干，殘渣加甲醇2 mL，作為對照藥材溶液。另取陰性對照樣品(缺失枸杞子藥材)，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。吸取上述三種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯－三氯甲烷－甲酸(3∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干。置紫外光燈(365 nm)下觀察。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上無相同顏色的斑點［1，4－5］(圖 2)。

圖2 枸杞子薄層鑒別圖

2.1.3 金銀花 取本品10 g，加三氯甲烷30 mL，超聲提取2次，每次20 min，濾過，合并濾液，濾液蒸干，用1 mL乙醇溶解，作為供試品溶液。另取綠原酸對照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為陽性對照品溶液。取缺失金銀花的顆粒照上法提取，作為陰性對照溶液。吸取上述三種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠H板上，以乙酸乙酯－甲酸－水(7 ∶2.5 ∶2.5)為展開劑，展開，取出，晾干，在紫外光燈下(365 nm)檢視，供試品色譜中，在與對照品綠原酸色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照色譜上則無［1，6－7］(圖 3)。

圖3 金銀花薄層鑒別

2.1.4 黃芪 取本品3 g，加50 mL水超聲提取40 min，濾液加乙醚提取2次，每次20 mL，乙醚液棄去，水液置水浴上加熱揮去醚，放冷，用水飽和正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，用1%氫氧化鈉試液洗2次，每次40 mL，洗液棄去，取正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取黃芪甲苷對照品1 mg，加甲醇2 mL，溶解，作為對照品溶液;取缺失黃芪的顆粒照上法提取，作為陰性對照溶液。吸取供試品溶液、對照品溶液及陰性對照液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水(13∶6∶2)10℃以下放置過夜的下層溶液為展開劑，展開(展距12 cm)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，110℃烘干，在紫外光燈(365 nm)下檢視，在與對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點［1，8－9］(圖4)。

圖4 黃芪薄層鑒別圖

2.2 綠原酸的含量測定

2.2.1 吸收波長的選擇

2.2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對照品13.00 mg置25 mL容量瓶中，用50%的甲醇溶液溶解定容至刻度作為總儲備液。取總儲備液2.5 mL定容至25 mL得儲備液。分別精密量取儲備液2、2.5、3、3.5、4 mL 定容至25 mL，即為標準對照品溶液。

2.2.1.2 供試品溶液的制備 取本品于研缽中研細，精密稱取5.0 g，置25 mL容量瓶中，加50%的甲醇溶液20 mL，超聲處理30 min，冷至室溫，50%的甲醇溶液加至刻度，搖勻，過濾，棄去初濾液，取續濾液5 mL，用50%的甲醇溶液定容至25 mL，搖勻，即為供試液。

2.2.1.3 光譜掃描 取標準品溶液及供試品溶液適量，在200～500 nm波長范圍內進行光譜掃描，得最大吸收波長為328 nm。

2.2.2 線性關系考察 取上述不同濃度的標準對照品溶液，搖勻后在328 nm處測定吸光度，以吸光度(A)為縱坐標，以濃度(C)(μg/mL)為橫坐標，得直線回歸方程:A=0.0053×C －0.0012(r=0.9999，n=5)。結果表明，綠原酸在 42.24 ～84.48 μg/mL范圍內具有良好的線性關系(圖5)。

圖5 綠原酸標準曲線

2.2.3 精密度試驗 取總儲備液1 mL，用50%甲醇溶液定容至100 mL，在328 nm處測定吸光度，重復5次，相對標準偏差(RSD)為0.382%。

2.2.4 穩定性試驗 取同一批樣品5份，同法制備，分別在 0、2、4、6、24 h 時在 328 nm 處測定吸光度，計算RSD值。結果RSD=0.733%，表明該方法在24 h內很穩定。

2.2.5 加樣回收率試驗 取已知含量的供試品0.5 g，精密稱定，再精密加入一定量的綠原酸對照品，按供試液的制備方法同法制備，在328 nm處測定吸光度，計算回收率(表1)。

表1 加樣回收率試驗結果

2.2.6 含量測定 精密稱取同一批次供試品0.5 g，共6份，按供試品溶液制備法制備，在328 nm處測定吸光度，結果綠原酸的平均含量為660.6792 μg/g。

3 討論

3.1 薄層鑒別 在研究女貞子的薄層鑒別時，根據參考文獻資料［2－3］選擇了幾種方法進行比較。首先是供試液的制備，文獻資料上都用的是加熱回流，采用這種方法，用時較長，操作不方便，于是改為超聲處理，過濾后取濾液，這樣時間大大地縮短了，而且超聲提取比較完全;在進行薄層展開時，采用過以正己烷－三氯甲烷－乙酸乙酯－冰乙酸(17∶10 ∶3 ∶0.3)為展開劑，結果噴以 5%香草醛乙酸－高氯酸(1∶4)溶液顯色后，供試品與對照品的斑點不在同一位置，且放在365 nm紫外光燈觀察時沒有相應的斑點。后改用以環己烷－丙酮－乙酸乙酯(5∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在110℃加熱至斑點顯色清晰。置紫外光燈(365 nm)下檢視，結果出現很清晰的薄層色譜圖，重現性更好，陰性樣品無干擾。

在研究枸杞子的薄層色譜鑒別時，參考文獻資料［4－5］選擇了幾種方法進行比較。首先是供試液的制備，文獻資料上都用的是加熱回流，冷卻，靜置一段時間后取上清液。采用這種方法，用時較長，提取不完全，不利于生產實際應用，所以改為超聲處理，過濾后取濾液，這樣時間大大地縮短了，而且超聲提取比較完全;其次是溶劑方面，文獻資料上提取的溶劑有乙醚、三氯甲烷，而本試驗選擇水。乙醚和三氯甲烷都是有毒液體，特別是乙醚具有很強的揮發性，極易燃且具有麻醉性，所以在不影響檢測結果的情況下，選擇了更為安全的水作為溶劑。在展開劑的選擇上，曾選用過甲苯－乙醚－冰乙酸(體積比10∶10∶0.1)和三氯甲烷－乙酸乙酯－苯－甲酸(5∶6∶3∶1)2種展開劑，但是相比于乙酸乙酯－三氯甲烷－甲酸(3∶2∶1)，后者的展開效果更好，圖像更清晰，重現性更好，陰性樣品無干擾。

在研究金銀花的薄層色譜鑒別時，參考文獻資料［6－7］選擇了幾種方法進行比較。供試液的制備方法中將水浴加熱回流改為超聲處理，這樣用時短，操作便捷，有利于生產實際應用;其次是薄層板的選擇。大量文獻資料用的都是硅膠G板，但是在試驗過程中發現，用硅膠G板進行復方黃芪金銀花顆粒中金銀花的鑒別時，出現陰性樣品干擾，所以將硅膠G板改為硅膠H板，這樣在同樣的條件下，硅膠H板展開效果更好，圖像更清晰，重現性更好，陰性樣品無干擾。

在研究黃芪的薄層鑒別［8－9］時，曾使用三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－水(10∶20∶11∶5)10℃以下放置的下層溶液為展開劑，發現目標斑點Rf值偏低，換用三氯甲烷－甲醇－水(13∶6∶2)10℃以下放置的下層溶液為展開劑后，發現斑點較為圓整，且Rf值比較合理。

3.2 含量測定方面 綠原酸為酚酸類成分，具有良好的水溶性。但由于分子結構中含有酯鍵、不飽和鍵及多元酚而不穩定，綠原酸水溶液易發生水解和氧化反應，雖然在制備供試溶液時使用的是50%甲醇溶液，但也應該將樣品溶液貯存在避光低溫的環境中，試驗過程中應盡量避光操作，最好選擇棕色的容器。

［1］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典2005年版二部［M］北京:中國農業出版社，2005.

［2］羅躍華，周國平，龍新華，等.金復康口服液質量標準研究［J］.中成藥，2001，23(3):180 －182.

［3］黃小平，楊大堅，張 毅.福壽威片質量標準研究［J］.重慶中藥研究，2004，49(1):13 －15.

［4］姚少威，許明旺，吳洪應.復方枸杞顆粒的質量標準研究［J］.時珍國醫國藥，2004，15(3):151 －152.

［5］劉美龍，嚴光輝.穿龍骨刺顆粒的質量標準研究［J］.海峽藥業，2009，21(7):114 －116.

［6］魏雪芳，陳 杰，李卓明.復方金銀花顆粒質量標準研究［J］.中成藥，2004，26(11):900 －904.

［7］郭用莊，廖彩霞，翟旭峰，等.金銀花配方顆粒質量標準的研究［J］.中成藥，2002，24(6):423 －425.

［8］何 娟，何秀英.黃芪四物湯顆粒的質量標準研究［J］.中國中醫藥科技，2009，16(3):217 －219.

［9］賈獻慧，王曉靜，王惟江.黃芪益腎膠囊的質量標準研究［J］.齊魯藥事，2009，28(9):528－531.