伸筋草對類風濕性關節炎大鼠踝關節滑膜組織ICAM-1、MMP-3及OPG/RANKL/RANK信號通路的影響

張妍妍，邢希旺，敖鵬，劉玉婕，肖洪彬*

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.天津科倫藥物研究有限公司，天津 300457)

流行病學研究表明，全球類風濕性關節炎(Rheumatoid arthritis，RA)的平均發病率在0.5%～1%之間，而我國大陸地區類RA的發病率為0.42%[1]。盡管從發病率來看，我國屬于RA低發病率國家，但是由于我國龐大的人口基數和人口結構的老齡化，近年來我國RA患者逐年增加。RA是一種慢性自身免疫性疾病，以關節炎性病變為主，如不加以控制會導致關節骨組織的損傷、畸形甚至喪失功能[2]。RA的高致殘率不僅影響患者本身的生活質量，而且為家庭和社會帶來巨大的經濟負擔。

由于病因尚未完全清晰，因此目前西醫無法根治RA，主要以免疫抑制劑和非甾體抗炎藥控制癥狀。中醫學在這方面具有獨特的優勢，研究表明多種天然藥物中的活性成分，不僅可以有效緩解RA的癥狀，而且能夠從一定程度上延緩疾病的進展[3-5]。中藥伸筋草(Lycopodium Clavatum)為石松科植物，《本草拾遺》中記載：味苦辛，溫，無毒。伸筋草歸肝、脾、腎經，具有祛風除濕、舒筋活絡的功效，中醫臨床常用于治療關節酸痛、屈伸不利。現代研究表明，伸筋草具有調節免疫、抗炎鎮痛等藥理作用[6]。

本研究采用注射弗氏完全佐劑的方法復制大鼠RA模型，通過大鼠滑膜組織HE染色病理變化、細胞間黏附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、基質金屬蛋白酶-3(Matrix metalloproteinase，MMP-3)的表達以及OPG/RANKL/RANK信號通路來探討伸筋草治療RA的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

清潔級，健康SD大鼠66只(多備10%的實驗動物備用)，5～6月齡，體質量(200±20)g，雄性，飼養環境：12 h-12 h明暗自動切換(7:00—19:00)；溫度控制：(25±2)℃；相對濕度控制：45%～75%。所有實驗動物均由黑龍江中醫藥大學GLP實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK(吉)-2018-0007。

1.2 主要實驗試劑

弗氏完全佐劑(批號：1002036152，西格瑪公司)，II型膠原(牛，凍干粉，Chondrex，批號：150342)，兔抗大鼠CD4單抗(廣州健侖生物科技有限公司，批號：20170315)，大鼠ICAM-1、MMP-3單抗(碧云天生物，批號：AF2443、AF1618)。

1.3 實驗藥物

伸筋草總生物堿提取物：實驗室自制，取適量加蒸餾水溶解，制得每mL含伸筋草生藥量0.054 g的伸筋草提取物濃縮液。

雷公藤多苷片：遠大醫藥黃石飛云制藥有限公司，規格：10 mg/片，批號：20170301。用羧甲基纖維素鈉配制成雷公藤多苷-CMC混懸液2.5 mg/mL。

1.4 主要實驗儀器

透射電鏡(荷蘭ASI，型號：Chee-tah120 Timepix)，恒溫箱(東莞市愛佩試驗設備有限公司，型號：AP-HX)，全自動免疫組化染色機(上海精密儀器儀表有限公司，型號：MY-2300)，電泳儀(美國Bio-rad，型號：1658033)。

2 實驗方法

2.1 模型復制

將II型膠原(牛)凍干粉溶解于0.1 mol/L的醋酸中，制成2 mg/mL的II型膠原(牛)醋酸溶液，備用。將大鼠腹腔注射劑量為40 mg/kg戊巴比妥鈉進行麻醉后仰位固定于手術臺。對大鼠進行右后足趾、尾根、背部3個部位皮下注射配置好的II型膠原(牛)醋酸溶液。每只大鼠3個位點共注射0.15 mL，注射10 d后，每只大鼠相同部位重復注射1次，以激發免疫反應[7]。另取10只正常對照組大鼠每次注射相同體積的生理鹽水。

2.2 實驗分組及給藥

按照2.1項下的方法，第二次皮下注射后第3天觀察大鼠后趾、尾部、耳部腫脹情況，以尾部、耳部和后趾出現炎性紅腫或者結節為成功復制RA模型的標志。將RA模型復制成功的50只Wistar雄性大鼠，按照體質量區組化隨機分為5組，即模型組、伸筋草高、中、低3個劑量組和陽性對照組，每組10只。

2.3 HE染色大鼠滑膜組織

在第二次皮下注射第4日起，各組大鼠開始灌胃給藥。伸筋草高、中、低劑量組每日分別給藥1.6 g/kg、0.8 g/kg、0.4 g/kg伸筋草提取物濃縮液(以伸筋草生藥量計)；正常對照組和模型組大鼠每日分別灌胃給予等體積的生理鹽水；陽性對照組每日灌胃5.4 mg/kg雷公藤多苷混懸液(以雷公藤多苷計)，連續21 d。于末次給藥后次日將大鼠麻醉后，脫頸處死，取右后踝關節，鈍性剝離關節滑膜組織置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。用4%的多聚甲醛固定，10%濃度的EDTA溶液進行脫鈣，梯度濃度乙醇脫水后[8]，用石蠟包埋，切片后進行HE染色，光學顯微鏡下觀察各組大鼠滑膜組織病理變化。

2.4 免疫組化方法測定滑膜組織ICAM-1、MMP-3

將大鼠踝關節滑膜組織切片后置于60 ℃的環境下1 h后，脫蠟復水。將切片用雙氧水和PBS反復洗滌各3次，添加一抗37 ℃恒溫1 h后，PBS反復沖洗3次，添加二抗，37 ℃溫育20 min后，加入SABC，37 ℃溫育30 min。漂洗后加入顯色劑。蒸餾水沖洗后，光鏡下觀察染色結果。每張切片隨機選擇5個高倍視野，用Image Pro Plus系統自動定量分析陽性區域光密度值。

2.5 Western Blot方法測定滑膜組織OPG、RANKL蛋白的表達

將低溫冷凍保存的各組大鼠滑膜組織粉碎后，加入細胞裂解液提取蛋白，進行SDS-PAGE電泳(蛋白上樣量為50 μg)，恒流電轉到PVDF膜后TBST漂洗，加入5%脫脂奶粉避光封閉2 h后漂洗3次，加入一抗(RANKL、OPG的1/1 000稀釋液)4 ℃恒溫過夜。漂洗3次后添加二抗(RANKL、OPG的1/5 000稀釋液)，TBST漂洗3次后加入ECL，曝光后分析條帶分子量及灰度值(選擇GAPDH為內參蛋白)。

2.6 統計學方法

3 實驗結果

3.1 伸筋草對RA大鼠踝關節滑膜組織病理的影響

HE染色實驗結果見圖1。正常對照組大鼠滑膜組織細胞排列整齊規則，結構完整，膜表面光滑未見增生，無炎性細胞浸潤和血管充血；模型組有明顯的淋巴細胞及單核細胞等炎性浸潤，滑膜組織細胞排列不規則，增生腫脹明顯。與模型組相比，陽性對照組和伸筋草高劑量組大鼠滑膜組織增生和炎性細胞浸潤顯著改善；伸筋草中、低劑量組有一定的緩解但不明顯。

圖1 RA大鼠踝關節滑膜組織HE染色(×400)

3.2 伸筋草對RA大鼠踝關節滑膜組織ICAM-1、MMP-3表達的影響

實驗結果見表1。與正常對照組相比，模型組大鼠踝關節滑膜組織ICAM-1、MMP-3的表達均顯著升高，伸筋草高、中、低劑量組均可以降低滑膜組織ICAM-1、MMP-3的水平，且呈劑量依賴性，其中高劑量伸筋草降低ICAM-1效果顯著(P<0.05)，高中劑量組降低MMP-3作用明顯(P<0.05)。

表1 伸筋草對RA大鼠踝關節滑膜組織ICAM-1、MMP-3表達的影響

3.3 伸筋草對RA大鼠踝關節滑膜組織OPG、RANKL蛋白表達及RANKL/OPG比值的影響

實驗結果見圖2、表2。

表2 伸筋草對RA大鼠踝關節滑膜組織OPG、RANKL蛋白表達及RANKL/OPG比值的影響

注：1.正常對照組；2.模型組；3.伸筋草高劑量組；4.伸筋草中劑量組；5.伸筋草低劑量組；6.陽性對照組。圖2 伸筋草對OPG、RANKL蛋白表達的影響Western Blot電泳圖

由實驗結果可以看出，與空白對照組相比，模型組大鼠踝關節滑膜組織中OPG、RANKL蛋白表達及RANKL/OPG的比值均顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，伸筋草各劑量組均可以降低OPG、RANKL表達和RANKL/OPG比值的趨勢，且呈現出一定的量效關系。高劑量組作用效果最佳，中劑量組次之，低劑量組雖有降低的趨勢，但無統計學意義(P>0.05)。

4 討論

RA是一種自身免疫性疾病，以關節骨損傷和慢性炎癥為主要特征。主要病理改變包括滑膜組織炎性細胞的浸潤、滑膜組織細胞的腫脹、充血、增生以及成纖維細胞樣滑膜細胞代謝的改變[9]。我國目前的RA患者超過500萬，RA嚴重危害我國老年人群的健康，臨床急需療效確切且安全性高的藥物。

伸筋草又名舒筋草，中醫用于治療關節腫痛、風寒濕痹、筋脈拘急。多個基礎研究表明伸筋草具有降低RA大鼠血清中炎性因子和鎮痛的作用[8]。本研究通過對大鼠滑膜組織的病理分析可知，伸筋草具有明顯的對抗RA大鼠滑膜組織增生和炎性浸潤的作用。這部分研究為后續探討伸筋草治療RA的作用機制奠定了藥效基礎。

ICAM-1是黏附分子中免疫球蛋白超家族的一員，是一種含有505個氨基酸的跨膜蛋白，廣泛存在于多種細胞表面。細胞膜上的ICAM-1主要與淋巴細胞功能相關抗原-1(LAF-1)相結合[10]，進而趨化血管中的白細胞向炎癥發生的組織聚集，并促進多種炎性細胞的黏附，如單核細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、嗜堿性粒細胞等[11]。MMP-3是研究較多的一類基質金屬蛋白酶，參與了滑膜組織成纖維細胞的侵襲和致病過程。臨床研究表明，MMP-3在RA患者關節組織的表達是正常患者的4倍以上[12]，因此臨床上常將患者關節液中MMP-3的水平作為早期鑒別診斷RA的重要生化指標和治療的主要療效指標[13-14]。本研究免疫組化的結果顯示伸筋草可以通過降低RA大鼠關節滑膜組織炎性因子的趨化、聚集、黏附來發揮治療作用。

細胞核因子κB受體活化因子配體(Receptor activator of the nuclear factor kappa B ligand, RANKL)，主要由成骨細胞表達，而RANK(Receptor activator of the nuclear factor kappa B)主要存在于破骨細胞的表面。RANKL與RANK結合后，會激活下游信號通路，促進破骨細胞的成熟和分化，這就使成骨細胞與破骨細胞間的平衡被打破，造成骨形成受損、骨吸收增加，進而導致關節周圍骨量減少、骨侵蝕和骨損傷[15]。OPG(Osteoprotegerin)俗稱骨保護素是一種分泌型糖蛋白，屬于TNF受體家族成員，最早是在1997年被發現，OPG可以抑制破骨細胞的形成。OPG能夠與RANKL競爭性結合，從而抑制RANKL與RANK的結合，進而抑制破骨細胞的過度分化、生成[16]。由此可以看出OPG/RANKL/RANK信號通路對成骨細胞與破骨細胞動態平衡的調控起著十分重要的作用。而RANKL/OPG的相對比值對于這個動態平衡的保持起到了關鍵作用[17]，這個比值能間接反映OPG/RANKL/RANK信號通路的激活程度。本研究Western Blot的結果表明伸筋草不僅可以降低滑膜組織OPG、RANKL蛋白的表達，同時還可以降低RANKL/OPG的比值，證明伸筋草可以通過調控OPG/RANKL/RANK信號通路在一定程度上恢復成骨細胞-破骨細胞的動態平衡，減少RA大鼠踝關節的損傷。

綜上所述，伸筋草治療弗氏佐劑所致大鼠RA的療效確切，其可以降低大鼠踝關節滑膜組織炎性因子的水平，并通過調控OPG/RANKL/RANK信號通路來發揮治療RA的作用。