女性白塞病患者血清CD4、CD14免疫細(xì)胞中差異表達(dá)基因篩選及生物信息學(xué)分析

張靜，邢衛(wèi)斌

天津市第五中心醫(yī)院，天津300450

白塞病(BD)是口腔阿弗他潰瘍、外生殖器潰瘍和虹膜炎三聯(lián)綜合征，可導(dǎo)致全身多系統(tǒng)病變。該病發(fā)病機制不明確，有研究發(fā)現(xiàn)，免疫因素在BD發(fā)病中的作用不容忽視[1]。目前關(guān)于BD的免疫學(xué)研究文獻(xiàn)并不多，多為BD合并其他疾病的病例報道或極少數(shù)遺傳易感基因方面的研究[2]。有學(xué)者曾發(fā)現(xiàn)，在BD患者外周血中，某些關(guān)鍵酶類會同時在CD14、CD4免疫細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，而且這些酶類與BD發(fā)病密切相關(guān)[3]。鑒于BD在成年女性中發(fā)病率較高，2019年5月，本研究利用公共數(shù)據(jù)庫中基因芯片數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)分析方法，觀察女性BD患者與正常人群血清CD4、CD14免疫細(xì)胞基因表達(dá)譜差異，旨在進(jìn)一步明確BD患者的免疫學(xué)發(fā)病機制。

1 資料與方法

1.1 樣本及數(shù)據(jù)來源 本次數(shù)據(jù)通過GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)檢索，檢索截止時間2019年5月。通過此次檢索發(fā)現(xiàn)了BD相關(guān)數(shù)據(jù)集GSE61399，包括BD患者CD4免疫細(xì)胞樣本9例、CD14免疫細(xì)胞樣本8例以及對應(yīng)健康人群的CD4免疫細(xì)胞樣本3例與CD14免疫細(xì)胞樣本9例(后文中分別簡稱為CD4免疫細(xì)胞實驗組和對照組，CD14免疫細(xì)胞實驗組和對照組)。所有入選樣本均為女性。

1.2 差異表達(dá)基因篩選 使用GPL570平臺注釋信息對芯片數(shù)據(jù)探針名稱進(jìn)行注釋，得到對應(yīng)的基因名稱。對于相同的基因表達(dá)數(shù)據(jù)以取列向均值方式進(jìn)行合并，得到了原始基因表達(dá)數(shù)據(jù)集。之后使用R軟件(https://www.r-project.org/)平臺scale函數(shù)對其進(jìn)行歸一化處理，通過limma R軟件進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選，引入BH方法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)校正。以log2|Fold Change|>2及校正P<0.05者作為差異表達(dá)基因。

1.3 差異表達(dá)基因通路富集分析 基于KEGG數(shù)據(jù)庫和Reactom數(shù)據(jù)庫，使用toppgene(https://toppgene.cchmc.org/)在線工具對差異基因進(jìn)行聯(lián)合通路富集分析。

1.4 差異表達(dá)基因GO富集分析 基于GO數(shù)據(jù)庫，使用R軟件包clusterProfiler v3.8.1對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO生物過程(GOBP)、分子功能(GOMF)、細(xì)胞組分(GOCC)的富集分析，在結(jié)果篩選時使用BH校正并篩選錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)，F(xiàn)DR<0.05的富集功能項作為最后結(jié)果。

1.5 核心基因篩選 使用String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)對所有差異表達(dá)基因建立相互作用網(wǎng)絡(luò)，并選取可信度在0.9以上的基因互作對。之后將這些互作對導(dǎo)入Cytoscape v3.6.1軟件(http://www.cytoscape.org/)中，建立差異基因相互作用網(wǎng)絡(luò)，使用節(jié)點篩選工具，將相互作用網(wǎng)絡(luò)篩選節(jié)點度≥10的基因作為核心基因。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因篩選結(jié)果 CD14免疫細(xì)胞實驗組和對照組的差異表達(dá)基因1 013個，其中506個表達(dá)上調(diào)、507個表達(dá)下調(diào)。CD4免疫細(xì)胞實驗組和對照組的差異表達(dá)基因2個(NOXA1、MEGF8)，均表達(dá)下調(diào)。

2.2 CD14免疫細(xì)胞差異表達(dá)基因KEGG和GO富集分析結(jié)果 由表1～4可見，大量差異基因參與了膜運輸通路及囊泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運通路；大量基因參與了蛋白酶體分解代謝過程、RNA的剪接、定位等生物學(xué)過程，參與核膜構(gòu)成，以及關(guān)鍵酶的結(jié)合、修飾、激活等。CD4免疫細(xì)胞差異表達(dá)基因數(shù)量少，無法做功能及通路富集。

2.3 核心基因篩選結(jié)果 將CD14免疫細(xì)胞組差異表達(dá)基因使用String數(shù)據(jù)庫匹配建立基因相互作用網(wǎng)絡(luò)，在此之中也將CD4免疫細(xì)胞組差異表達(dá)基因引入，觀察其所處網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的重要性，篩選出節(jié)點度≥10的基因(核心基因)分別為RPS27A、GTPBP4、NDUFAB1、MRPL18、NIFK、MRPS5、MRPL46(節(jié)點度分別為16、12、12、10、10、10、10)。

3 討論

BD是一種以血管炎為病理基礎(chǔ)的慢性、復(fù)發(fā)性、多系統(tǒng)受累的全身性疾病。女性外生殖器潰瘍很容易與外陰炎性潰瘍相混淆，甚至曾經(jīng)有宮頸受累的BD的報道[4]，所以BD容易被誤診、誤治。BD發(fā)病機制尚不明確，有學(xué)者[5]在建立的BD眼受累致盲小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，CD4免疫細(xì)胞表達(dá)水平明顯高于正常組，并且與IL-2、IL-7水平明顯相關(guān)。同時，活動期的BD患者CD4免疫細(xì)胞中GATA3、TGF-β基因啟動子區(qū)甲基化水平明顯升高，且與其mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；而GATA3表達(dá)水平進(jìn)一步影響IL-4表達(dá)水平，從而導(dǎo)致CD4免疫細(xì)胞分泌更多細(xì)胞因子參與BD發(fā)病過程[6]。

表1 CD14免疫細(xì)胞差異表達(dá)基因KEGG分析結(jié)果

表2 CD14免疫細(xì)胞差異表達(dá)基因GOBP富集分析結(jié)果

表3 CD14免疫細(xì)胞差異表達(dá)基因GOCC富集分析結(jié)果

表4 CD14免疫細(xì)胞差異表達(dá)基因GOMF富集分析結(jié)果

本研究發(fā)現(xiàn)，CD4免疫細(xì)胞組篩選出的差異基因僅有2個，可能與樣本量少、可用數(shù)據(jù)有限有關(guān)。然而，本研究發(fā)現(xiàn)CD14免疫細(xì)胞顯著性差異基因數(shù)量非常大，可以推測在BD致病因素中，CD14免疫細(xì)胞可能發(fā)揮著極為重要的作用。CD14是一種主要存在于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞表面的白細(xì)胞分化抗原，作為LPS/LPS結(jié)合蛋白復(fù)合物受體與其結(jié)合，發(fā)揮細(xì)胞毒作用、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。有研究顯示，BD患者血清可誘導(dǎo)CD14免疫細(xì)胞表型出現(xiàn)極化反應(yīng)，產(chǎn)生M1樣巨噬細(xì)胞，從而發(fā)揮更強的病理學(xué)效應(yīng)[7]。國內(nèi)有研究發(fā)現(xiàn)，與BD有著同樣病理學(xué)基礎(chǔ)的重度子癇前期的產(chǎn)婦分娩后蛻膜組織和正常產(chǎn)婦蛻膜組織相比，CD14免疫細(xì)胞的表達(dá)水平明顯增高[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，更多的CD14免疫細(xì)胞差異表達(dá)基因主要富集在RNA剪接轉(zhuǎn)運等通路，參與蛋白酶體蛋白分解過程。因此，我們有理由推測BD患者是通過這些差異表達(dá)基因上調(diào)CD4和CD14免疫細(xì)胞的表達(dá)水平，從而引起它們釋放更多的細(xì)胞因子和細(xì)胞毒性物質(zhì)，并且這些基因也可能直接參與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及細(xì)胞吞噬過程，最終導(dǎo)致血管閉塞、壞死，引起B(yǎng)D相關(guān)癥狀。

本研究中，與健康對照組相比，BD患者血清CD14免疫細(xì)胞中差異表達(dá)基因1 013個，以下調(diào)基因所占比例較高，其中RPS27A、GTPBP4下調(diào)最為明顯;在上調(diào)基因里以NDUFAB1最為顯著。而CD4免疫細(xì)胞實驗組和對照組之間差異表達(dá)基因只有2個，這與以往文獻(xiàn)報道有所不同，有待后續(xù)進(jìn)一步探索。目前關(guān)于以上差異表達(dá)基因在BD中的作用研究極少，較多研究集中在腫瘤方面。例如，RPS27A是一種核糖體蛋白，除了參與蛋白質(zhì)合成，還參與轉(zhuǎn)錄、修復(fù)、細(xì)胞發(fā)育和凋亡調(diào)控等多種生物學(xué)過程，在肝癌、骨肉瘤、宮頸癌等細(xì)胞中均有過量表達(dá)[9]。BD患者中RPS27A表達(dá)下調(diào)，這一點符合BD的病理特征，腫瘤組織需要更多的血液供應(yīng)，與BD的血管閉塞壞死過程截然相反。但RPS27A基因是否通過間接調(diào)控CD14+免疫細(xì)胞表達(dá)水平從而對血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生影響抑或直接調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡而導(dǎo)致BD發(fā)生還需要進(jìn)一步證實。研究顯示，GTPBP4基因沉默后，結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力降低，遷移距離縮短，凋亡率高，GTPBP4可能通過調(diào)節(jié)p53和survivin蛋白的表達(dá)來實現(xiàn)上述效應(yīng)[10]。因此我們推測，BD患者GTPBP4基因下調(diào)也可能通過以上機制導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡加速從而致病。本研究發(fā)現(xiàn)的表達(dá)上調(diào)基因NDUFAB1是參與線粒體能量和活性氧(ROS)代謝的重要調(diào)節(jié)器，可以有效保護(hù)高脂飲食小鼠免受肥胖和胰島素抵抗的影響，也可以減少ROS對心臟的損傷；而在BD患者中，NDUFAB1過度表達(dá)是否因為免疫炎癥反應(yīng)刺激而反饋性啟動機體保護(hù)機制，進(jìn)一步使血管內(nèi)皮細(xì)胞免受損傷，還需要進(jìn)一步證實[11,12]。

綜上所述，BD患者CD4、CD14免疫細(xì)胞中差異表達(dá)基因主要參與膜運輸通路及囊泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運通路，參與蛋白酶體分解代謝、RNA剪接、定位等生物學(xué)過程，參與核膜構(gòu)成，以及關(guān)鍵酶的結(jié)合、修飾、激活等。篩選出與BD發(fā)病相關(guān)的核心基因主要有RPS27A、GTPBP4、NDUFAB1、MRPL18、NIFK、MRPS5、MRPL46。