燈盞花乙素治療高脂血癥的潛在分子生物學(xué)機(jī)制分析

劉思瑩，任蓁，凌爽，牛文穎，王雨晴，郭婉琴，肖洪彬

1黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱150040；2黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)；3黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院

高脂血癥是動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病、糖尿病等疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素，糾正高脂血癥對(duì)于預(yù)防心腦血管疾病具有重要意義。高脂血癥的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，包括脂蛋白的吸收、抑制合成和促進(jìn)排泄等多種因素的相互作用，使用單一靶向藥物治療效果不佳。中藥中多組分的降脂作用可能參與脂質(zhì)代謝調(diào)控的各個(gè)步驟，對(duì)正常脂質(zhì)合成和代謝可能具有重要意義。目前許多中藥都被用于調(diào)節(jié)血脂，治療心腦血管疾病[1]。因此，開發(fā)中藥多靶點(diǎn)、多途徑治療對(duì)防治高脂血癥具有重要意義。燈盞花素是從燈盞細(xì)辛中提取的一種黃酮類有效成分，其主要成分為燈盞花乙素。燈盞花乙素具有較強(qiáng)的生物學(xué)活性，亦是臨床上常用的單體化合物成分，已被制成多種劑型用于治療心腦血管疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、腦供血不足、心絞痛等[2，3]。臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，燈盞花乙素可調(diào)節(jié)血脂、降低血液黏度、提高機(jī)體抗缺氧能力，從而延緩心腦血管疾病及其慢性并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展[4，5]。2020年3～5月，本研究嘗試通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，探索燈盞花乙素治療高脂血癥潛在的分子機(jī)制，為其臨床應(yīng)用及高脂血癥相關(guān)疾病的研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件 有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(PubChem，http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)，Protein Data Bank(PDB，https://www.rcsb.org/)，Pharmmapper平臺(tái)服務(wù)器(http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/check.php)，Venny2.1軟件(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，String11.0軟件(https://string-db.org/)，Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)，GeneCards數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org/)和OMIM數(shù)據(jù)庫(https://www.omim.org/)。

1.2 化合物-靶點(diǎn)基因-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過Pubchem數(shù)據(jù)庫檢索燈盞花乙素(Scutellarin)的3D化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)，下載保存為mol2格式并上傳到Pharmmapper平臺(tái)服務(wù)器，獲取藥效團(tuán)文件，通過手工檢索、聯(lián)合uniprot數(shù)據(jù)庫和使用Perl腳本，尋找藥效團(tuán)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，物種限定為“Homo sapiens”。最后將獲取的靶點(diǎn)合并去重，即為燈盞花乙素潛在作用靶點(diǎn)。以“Hyperlipidemia”為關(guān)鍵詞，在GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫中篩選出高脂血癥相關(guān)靶基因，得到疾病相關(guān)的靶點(diǎn)基因。將燈盞花乙素化合物潛在靶點(diǎn)基因和疾病靶點(diǎn)基因同時(shí)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)基因-疾病網(wǎng)絡(luò)，最后運(yùn)用Network Analyzer功能分析其拓?fù)鋵W(xué)屬性。

1.3 燈盞花乙素作用靶點(diǎn)蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過Venny2.1軟件，提交疾病和藥物靶點(diǎn)，獲取兩者共同作用靶點(diǎn)。將篩選得到的共有靶點(diǎn)基因上傳至String平臺(tái)，建立PPI網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置蛋白種類為“Homo sapiens”，隱藏網(wǎng)絡(luò)中孤立的蛋白，其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，導(dǎo)出PPI網(wǎng)絡(luò)圖，分析統(tǒng)計(jì)靶點(diǎn)蛋白關(guān)聯(lián)頻次。將String平臺(tái)篩選出來的具有相互作用功能的基因?qū)隒ytoscape3.7.2軟件，通過拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)中cytoHubba插件中最大派系中心度分析并篩選出燈盞花乙素治療高脂血癥的核心靶點(diǎn)基因。

1.4 核心靶點(diǎn)基因的GO生物過程及KEGG通路富集分析 將上述方法篩選出的PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)基因利用R cluster Profiler包進(jìn)行基因本體GO生物過程注釋和KEGG通路富集分析，以P<0.05且從小到大排序，選取前20個(gè)GO生物過程注釋及KEGG通路。利用R ggplot2包繪制相應(yīng)圖形。

1.5 燈盞花乙素與核心靶點(diǎn)蛋白的分子對(duì)接 分子對(duì)接技術(shù)是驗(yàn)證分子和靶點(diǎn)作用關(guān)系的有效途徑，將燈盞花素活性成分作為配體、PPI網(wǎng)絡(luò)中degree前6位的靶點(diǎn)作為受體，進(jìn)行分子對(duì)接。在PubChem CID下載燈盞花乙素活性成分的三維結(jié)構(gòu)，在PDB數(shù)據(jù)庫下載核心靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)，用小分子結(jié)構(gòu)繪制軟件ChemBioDrew對(duì)其進(jìn)行常規(guī)預(yù)處理，然后用Pymol軟件刪除多余的蛋白結(jié)構(gòu)，去掉水分子以及其他無關(guān)配體，導(dǎo)入AutoDock Vina1.1.2軟件選擇半柔性對(duì)接模式，對(duì)接參數(shù)為默認(rèn)。其中，結(jié)合能小于0表明配體分子能夠和受體蛋白自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能小于-5.0 kJ/mol，表明其結(jié)合性好，結(jié)合能越小則對(duì)接越好[6]。

2 結(jié)果

2.1 化合物-靶點(diǎn)基因-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建情況 共獲得化合物靶點(diǎn)基因366個(gè)，疾病靶點(diǎn)基因1 280個(gè)，構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)基因-疾病網(wǎng)絡(luò)，獲得疾病基因與化合物靶點(diǎn)基因映射，篩選出共同作用靶點(diǎn)基因39個(gè)，確定為燈盞花乙素治療高脂血癥的的靶點(diǎn)基因。包括E3-SUMO蛋白轉(zhuǎn)移酶NSE2(NSMCE2)、NLR家族含3的Pyrin域(NLRP3)、脂肪酸合酶(FAS)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶(ABCA1)、δ-氨基乙酰丙酸脫水酶(ALAD)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、細(xì)胞色素P450 7A1(CYP7A1)、羧肽酶B2(CPB2)、胰腺三酰甘油脂肪酶(PNLIP)、膜伯胺氧化酶(AOC3)、Krueppel樣因子2(KLF2)、髓過氧化物酶(MPO)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)、G1/S特異性細(xì)胞周期蛋白D1(CCND1)、DNA連接酶4(LIG4)、3磷酸甘油脫氫酶1樣蛋白(GPD1L)、基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP1)、膜聯(lián)蛋白A5(ANXA5)、線粒體解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)、血紅素加氧酶1(HMOX1)、中鏈特異性酰基輔酶A脫氫酶(ACADM)、糖原磷酸化酶(PYGL)、E3泛素蛋白連接酶(TRIM21)、基質(zhì)金屬蛋白酶14(MMP14)、肌紅蛋白(MB)、膜相關(guān)鳥苷酸激酶(MAGI2)、1,6-雙磷酸果糖酶1(FBP1)、過氧化氫酶(CAT)、核受體共激活劑2(NCOA2)、谷胱甘肽過氧化物酶3(GPX3)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶1(PTGS1)、脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP2)、雄激素受體(AR)、肌酸激酶M型(CKM)、血管內(nèi)皮生長因子B(VEGFB)、絲氨酸蛋白酶1(PRSS1)。

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)及其核心靶點(diǎn)基因 將篩選的39個(gè)共有靶點(diǎn)蛋白上傳至String平臺(tái)，建立PPI網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)共有37個(gè)節(jié)點(diǎn)，98條相互作用關(guān)系，平均度值為5.38。PPI網(wǎng)絡(luò)中degree最高的前6個(gè)基因?yàn)镃AT、CRP、HMOX1、PTGS2、MPO、ACE。

2.3 核心靶點(diǎn)基因GO生物過程及KEGG通路富集分析結(jié)果 共有靶點(diǎn)基因主要參與的生物過程包括氧化應(yīng)激反應(yīng)、氧氣水平的反應(yīng)、抗生素反應(yīng)、缺氧的反應(yīng)、營養(yǎng)水平的反應(yīng)、細(xì)胞排毒反應(yīng)等(表1)；涉及的信號(hào)通路主要有PPAR信號(hào)通路、脂肪的消化吸收、花生四烯酸代謝、TNF信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、膽固醇代謝、調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞中的脂肪分解等(表2)。

表1 核心靶點(diǎn)基因的GO生物過程分析結(jié)果

2.4 燈盞花乙素與靶蛋白分子對(duì)接結(jié)果 燈盞花乙素與degree較高的6個(gè)核心靶點(diǎn)蛋白的活性位點(diǎn)均能夠形成2個(gè)以上的氫鍵。燈盞花乙素與CAT、MPO、PTGS2、ACE、HMXO1、CRP的結(jié)合能分別為-11.4、-10.8、-10.6、-9.8、-9.5、-8.9 kJ/mol，其中燈盞花乙素與CAT蛋白的結(jié)合能最低，結(jié)合能力最強(qiáng)。燈盞花乙素能與CAT的活性位點(diǎn)ARG 112、ARG 72、SER 114和TYR 358形成氫鍵，這也是促使其結(jié)合到活性位點(diǎn)的主要作用力。

3 討論

高脂血癥的發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，多種生物過程和多種信號(hào)通路參與了膽固醇的代謝過程。中藥被認(rèn)為能夠針對(duì)炎癥、氧化應(yīng)激、能量代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、凋亡等多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮治療高脂血癥的作用。燈盞花乙素是一種黃酮苷類化合物，可通過抗氧化活性來防治非酒精性脂肪肝[7]、動(dòng)脈粥樣硬化[8]、缺血再灌注損傷[9]、胰島素抵抗[10]等相關(guān)代謝性疾病。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)建立藥物化合物-靶點(diǎn)基因-疾病網(wǎng)絡(luò)和核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)CAT、HOXM1、CRP、MPO、PTGS2、ACE是燈盞花素治療高脂血癥的核心靶點(diǎn)；PPI網(wǎng)絡(luò)分析表明，這些蛋白均處于網(wǎng)絡(luò)的核心位置，至少與7個(gè)蛋白存在相互作用關(guān)系。CAT和HOXM1具有抗氧化、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)微循環(huán)等作用[11，12]。CRP是由肝細(xì)胞合成和分泌的球蛋白，受炎癥因子調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)，是評(píng)價(jià)炎癥性疾病的指標(biāo)之一，并參與血栓形成和動(dòng)脈粥樣硬化的病理過程，是冠心病、腦卒中等疾病的危險(xiǎn)因素之一[13，14]。MPO被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)的標(biāo)志物之一，在生理?xiàng)l件下MPO參與機(jī)體的固有免疫，過量釋放的MPO可誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，大量超氧化物和氧化物形成，造成機(jī)體炎癥部位損傷。有研究表明，MPO通過多種途徑參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的全過程[15]。PTGS2是體內(nèi)前列腺素合成的關(guān)鍵酶，在正常組織中很少表達(dá)，在炎癥組織中呈高表達(dá)，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[16，17]。ACE是一種含鋅離子的金屬蛋白酶，能夠催化血管緊張素Ⅰ向血管緊張素Ⅱ轉(zhuǎn)化，使血管收縮而增加血壓。通過抑制ACE使血管緊張素Ⅱ形成減少和緩激肽代謝減少，導(dǎo)致動(dòng)脈和靜脈系統(tǒng)擴(kuò)張、動(dòng)脈血壓降低。目前ACE2研究比較廣泛，它與心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化和2型糖尿病等關(guān)系密切。ACE主要在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中有大量表達(dá)，這也提示ACE有可能是抗動(dòng)脈粥樣硬化的重要因素之一[18]。上述結(jié)果表明，燈盞花乙素治療高脂血癥是通過多靶點(diǎn)、多途徑來實(shí)現(xiàn)的。

表2 核心靶點(diǎn)基因的KEGG通路富集分析結(jié)果

從GO富集分析結(jié)果可知，差異基因主要參與氧化應(yīng)激反應(yīng)、缺氧的反應(yīng)、抗生素反應(yīng)、營養(yǎng)水平的反應(yīng)、細(xì)胞排毒反應(yīng)、細(xì)胞氧化劑反應(yīng)等生物過程。KEEG分析結(jié)果顯示，核心靶點(diǎn)基因參與的信號(hào)通路主要是PPAR信號(hào)通路，其次是脂肪的消化吸收、AMPK信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、膽固醇代謝、調(diào)節(jié)脂肪分解等。PPAR參與調(diào)節(jié)肝臟炎癥和脂質(zhì)代謝過程，促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化，提高血糖攝取，在動(dòng)脈粥樣硬化的形成過程中起著重要的作用[19，20]。有研究報(bào)道，燈盞花乙素可通過PPARγ/PGC-1α/Nrf2途徑作用于下游靶點(diǎn)CAT、HMOX1，調(diào)控其抗氧化應(yīng)激信號(hào)通路，減少脂質(zhì)過氧化作用，降低高脂喂養(yǎng)大鼠的血脂水平[21]。高脂狀態(tài)下，血脂升高，自由基生成增加，大量的自由基破壞了機(jī)體氧化平衡，導(dǎo)致脂蛋白發(fā)生氧化修飾，增強(qiáng)氧化應(yīng)激和內(nèi)毒素形成，從而造成內(nèi)皮損傷。燈盞花素可能通過干預(yù)氧化應(yīng)激損傷、TNF信號(hào)通路和炎癥反應(yīng)相關(guān)信號(hào)通路等途徑協(xié)同發(fā)揮治療高脂血癥的作用。我們采用分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證分子和靶點(diǎn)作用的關(guān)系，結(jié)果顯示，燈盞花乙素與degree較高的6個(gè)核心靶點(diǎn)蛋白的活性位點(diǎn)均能夠形成2個(gè)以上的氫鍵，結(jié)合能力較強(qiáng)，提示燈盞花乙素的作用機(jī)制與調(diào)控抗氧化因子和炎癥因子有關(guān)。

綜上所述，本研究以燈盞花乙素為研究對(duì)象，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對(duì)接方法分析了其治療高脂血癥的核心靶點(diǎn)及通路，并初步驗(yàn)證了燈盞花素與核心靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系和結(jié)合力，揭示了燈盞花素治療高脂血癥具有多靶點(diǎn)、多通路的作用機(jī)制。