虎杖苷對丙酮醛誘導施萬細胞損傷的干預作用

陳露露，祁佐良

中國醫學科學院北京協和醫學院整形外科醫院，北京100144

難治性創面修復是修復重建外科領域的一大難題。由糖尿病引起的周圍神經及其相應營養血管的結構和功能障礙是導致難治性創面的非常重要的原因。大量動物實驗和臨床研究表明，丙酮醛(MGO)和糖基化終產物(AGE)的堆積在周圍神經病變及血管病變中起到了至關重要的作用[1]。虎杖苷(PD)是從植物虎杖中提取的單體，具有多種生物學活性和廣泛的藥理學作用[2～6]。近年來，PD對糖尿病相關心血管及腎臟疾病的治療作用已被廣泛研究[7～9]，但其對糖尿病周圍神經病變的影響尚不明確。為初步探討PD對周圍神經系統的影響，2016年4月～2018年4月，我們以周圍神經系統中的膠質細胞——施萬細胞作為研究對象，采用MGO體外損傷施萬細胞以模擬體內糖尿病周圍神經病變模型[10]，觀察PD預處理后施萬細胞的活性變化及凋亡情況，探討PD對施萬細胞的保護作用，為臨床上難治性創面和周圍神經病變的修復提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞與主要材料 大鼠施萬細胞系RSC96取自中國科學院。高糖DMEM培養基購自美國Thermo公司。0.25%胰酶、青霉素-鏈霉素溶液、胎牛血清(FBS)均購自加拿大Gibco公司。二甲基亞砜(DMSO)購自上海生工生物工程有限公司。磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.4% MGO工作液、PD、4%多聚甲醛溶液(PFA)、1% TritonX-100、熒光封片劑購自美國Sigma公司。CCK-8試劑盒購自碧云天公司。兔多克隆一抗購自英國Abcam公司。羊抗兔IgG熒光二抗、TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司。TUNEL染色試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司。熒光定量RT-PCR引物由北京擎科生物科技有限公司合成。GAPDH上游引物序列為5′-GCTCTCTGCTCCTCCCTGTTCTA-3′，下游引物序列為5′-TGGTAACCAGGCGTCCGATA-3′；Caspase-3基因上游引物序列為5′-GCTGGACTGCGGTATTGAGA-3′，下游引物序列為5′-CCATGACCCGTCCCTTGA-3′。

1.2 細胞分組及干預方法 施萬細胞采用高糖DMEM培養液于37 ℃、5% CO2條件培養箱中培養，當生長至90%融合時采用0.25%胰酶進行消化傳代，并以(1～2)×105/mL重新接種培養以進行后續實驗。將細胞采用4% PFA固定和10%羊血清封閉后，加入GFAP抗體、MBP抗體(0.5% BSA稀釋)和羊抗兔二抗行免疫熒光染色以鑒定細胞特性。將施萬細胞分為空白對照組、MGO組、PD組。空白對照組細胞體外培養48 h后改用無血清培養基培養，不加入任何藥物處理。MGO組細胞體外培養48 h后改用無血清培養基培養12 h，隨后加入1.65 mmol/L的MGO分別培養6、24 h。PD組細胞培養48 h后改用無血清培養基，同時分別加入50、100、200、300 μmol/L的PD培養12 h，隨后加入1.65 mmol/L的MGO分別培養6、24 h。

1.3 細胞活性檢測 吸除96孔板中各組細胞的上清液，PBS清洗后，每孔加入100 μL的無血清DMEM培養液和10 μL的CCK-8試劑。將96孔板放入培養箱內孵育2 h，隨后吸取上清液于新96孔板中。最后采用酶標儀測定各孔450 nm波長處吸光度(A)值。細胞活性=(實驗孔A值-空白孔A值)/(對照孔A值-空白孔A值)×100%。對照組細胞活性設為100%。

1.4 細胞凋亡檢測 采用TUNEL染色試劑盒進行染色。細胞樣本采用4% PFA固定30 min后用PBS清洗，加入1% TritonX-100室溫放置3～5 min后用PBS清洗。細胞中加入100 μL配好的反應液，37 ℃孵育30 min，隨后PBS清洗。吸干水分后，加入50 μL的TdT酶反應液，37 ℃避光孵育60 min，隨后PBS清洗。吸干水分后，加入50 μL的TdT酶反應液，37 ℃避光孵育60 min，PBS清洗。加入50 μL的Streptavidin-TRITC標記液，37 ℃避光孵育30 min，隨后PBS清洗。最后DAPI染細胞核10 min，PBS清洗，封片劑封片。于熒光顯微鏡下(100×)隨機拍攝6個視野照片，計算TUNEL陽性細胞率即為細胞凋亡率。

1.5 細胞中Caspase-3 mRNA檢測 采用RT-PCR法。將各組待檢測細胞移去培養液后PBS清洗。加入1 mL的TRIzol反復吹打，加入氯仿400 μL，震蕩30 s，4 ℃靜置15 min后以12 000 r/min、4 ℃離心15 min。取上層無色液體，加入相同量的異丙醇，顛倒混勻靜置10 min后以12 000 r/min、離心半徑8 cm、4 ℃離心10 min。舍棄上清，加入75%乙醇以7 500 r/min、4 ℃離心5 min。用40 μL的DEPC水溶解RNA，分光光度計測定濃度。按每管2 μg RNA進行逆轉錄。PCR反應體系12 μL包括4 μL的Buffer、1 μL的酶抑制劑、1 μL的Oligo、1 μL的逆轉錄酶、1 μL的dNTP、RNA及水。反應條件為30 ℃、10 min，42 ℃、60 min。最后所得樣本以4 ℃保存。以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達量[11]。

2 結果

2.1 各組細胞活性比較 損傷處理后6、24 h，MGO組細胞活性低于空白對照組，PD組細胞活性高于MGO組(P均<0.05)；PD組中，100 μmol/L PD處理的細胞活性高于50 μmol/L，而200、300 μmol/L PD處理的細胞活性低于100 μmol/L(P均<0.05)，提示PD濃度為100 μmol/L時對施萬細胞RSC96具有最佳的保護作用，而200、300 μmol/L濃度可能對細胞已經具有損傷作用。因此在后續凋亡實驗中，PD組選擇100 μmol/L亞組的數據進行分析。具體結果見表1。

表1 不同損傷處理時間各組細胞活性比較

2.2 各組細胞凋亡率比較 損傷處理后24 h各組細胞凋亡率均高于損傷后6 h(P均<0.05)；損傷處理后6、24 h，MGO組細胞凋亡率高于空白對照組，PD組細胞凋亡率低于MGO組(P均<0.01)。見表2。

表2 不同損傷處理時間各組細胞凋亡率比較

2.3 各組細胞中Caspase-3 mRNA表達比較 損傷處理后6、24 h，MGO組細胞Caspase-3 mRNA相對表達量高于空白對照組，PD組細胞Caspase-3 mRNA表達低于MGO組(P均<0.05)。見表3。

表3 不同損傷處理時間各組細胞中Caspase-3 mRNA表達比較

3 討論

周圍神經系統是由膠質細胞(即施萬細胞)和神經元細胞組成，其功能異常的原因多見于外傷或自身疾病。在自身疾病中，由糖尿病引起的末梢周圍神經病變在臨床中最常見。糖尿病神經病變是指體內長期的高血糖引起神經系統出現各種病理生理異常從而產生的神經系統損害，其中末梢周圍神經系統最常受累。糖尿病周圍神經病變是一個長期的過程，具體發病機制尚不十分清楚，可能包含多種途徑的激活，如MGO和AGE的大量堆積、氧化應激反應、蛋白激酶C通路的活化、多元醇通路的激活等[12]。由于其產生機制十分復雜，目前很難在體外完全模擬出體內的神經病變。

高糖引起的MGO、AGE的形成和大量堆積是糖尿病周圍神經病變發生的主要機制之一[1,13]。MGO是AGE的二羰基前體，在正常機體內其水平很低。糖尿病患者體內MGO的含量異常增高，大量聚集的MGO可引起組織細胞損傷，還可通過生成AGE對機體產生明顯的毒性作用[14]。鑒于以上原因，目前許多研究采用MGO體外損傷刺激細胞來間接模擬糖尿病病損[9,10]。施萬細胞是周圍神經系統特有的膠質細胞，在周圍神經系統的發育和再生中發揮著至關重要的作用。當機體發生糖尿病周圍神經病變時，施萬細胞出現反應性、增生性和退行性改變，發生凋亡、壞死，進一步導致神經軸突出現病理損害，最終使周圍神經發生不可逆損傷[15]。因此，保護施萬細胞的結構和功能是防治糖尿病周圍神經病變中不可或缺的重要環節。

PD是白藜蘆醇與葡萄糖結合的產物，屬于一種芪類化合物，具有多種藥理學作用。其分子中含有3個酚羥基，為一種氧自由基清除劑，可通過調節活性氧的產生和保護線粒體功能來發揮強效抗氧化和抗炎作用[16,17]。與白藜蘆醇相比，PD的抗氧化、清除氧自由基的能力更強[18]。PD的抗衰老及對中樞神經、心肌、肝臟、肺臟等的保護作用已被大量報道[16]。本研究以施萬細胞為研究對象，以MGO誘導損傷，并觀察PD的干預作用。本研究結果顯示，PD預處理能有效地減弱MGO對施萬細胞RSC96的損害，維持細胞活性，抑制細胞凋亡，且在細胞損傷早期(6 h)和晚期(24 h)均表現出穩定的保護作用。這提示PD對糖尿病周圍神經病變具有一定的防治作用。值得一提的是，PD組中的200、300 μmol/L PD處理的細胞活性明顯低于100 μmol/L，說明200 μmol/L的PD已經呈現毒性作用，PD只有在一定濃度范圍內才能更好地發揮保護功能。

目前認為，經典的凋亡途徑分為三條，即線粒體途徑、死亡受體途徑及內質網途徑[19]。三條途徑中除了線粒體途徑中的AIF途徑(通過線粒體釋放直接誘導凋亡)，其他途徑都可經過Caspase家族的激活實現凋亡。在Caspase家族中，Caspase-3是最重要的效應性蛋白裂解酶，是細胞凋亡信號下游的關鍵執行者。本研究結果顯示，施萬細胞經MGO處理后，細胞凋亡率和細胞中Caspase-3 mRNA表達水平明顯增高，說明MGO具有明顯的誘導凋亡作用；而PD預處理可有效減少細胞凋亡率和Caspase-3 mRNA表達，證實PD可通過抑制施萬細胞的凋亡達到保護細胞的作用。

結合上述研究結果，我們認為，PD預處理可減輕MGO誘導的施萬細胞損傷，維持細胞活性，減少細胞凋亡。本研究結果為臨床應用PD防治周圍神經病變提供了理論參考。