嬰幼兒配方奶粉中牛磺酸的檢測研究進(jìn)展

王丙然,任德財(cái),李星,屈巖峰

1(黑龍江東方學(xué)院，黑龍江 哈爾濱，150066)2(雅士利國際集團(tuán)有限公司, 廣東 潮州， 515638) 3(哈爾濱學(xué)院，黑龍江 哈爾濱， 150086)

?；撬峥梢宰鳛槿松顒?dòng)的潤滑劑，參與人體內(nèi)必要的生理活動(dòng)，幫助人體維持和調(diào)節(jié)正常的生命狀態(tài)[1-2]，尤其是在促進(jìn)嬰幼兒大腦和神經(jīng)中樞系統(tǒng)的發(fā)育方面作用比較明顯[3]，在增強(qiáng)鈣的吸收和心血管功能方面也發(fā)揮了重要作用，是嬰幼兒配方奶粉中重要的營養(yǎng)成分。

?；撬崾且环N在常溫下呈無色、四面針狀的晶體，微酸，易溶于水，難溶于乙醚、無水乙醇等有機(jī)溶劑。?；撬崾且环N含硫氨基酸，分子質(zhì)量125.15，熔點(diǎn)300 ℃，穩(wěn)定性強(qiáng)，具有一定的抗氧化能力，能夠作為生化試劑和潤滑劑被使用[4]。?；撬峤Y(jié)構(gòu)中存在氨基和磺酸基，在體內(nèi)以酸堿兩性離子存在，解離常數(shù)比蛋白氨基酸都小，具有較強(qiáng)的酸性。?；撬釓V泛存在于自然界中，尤其是在海洋生物體內(nèi)大量存在，其在生物體內(nèi)具有重要的作用，溶解后是小分子化合物，不容易通過細(xì)胞膜，沒有抗原性[5]。

?；撬峋哂泻軓?qiáng)的生物學(xué)功能，它是以游離的方式大量存在于肌肉、心臟和大腦中，是重要的營養(yǎng)素[6-7]。人體自身只能合成較少量的?；撬?，人類需要通過食物來補(bǔ)充足夠的牛磺酸。目前，?；撬嵋驯惶砑拥绞称分?，比如保健食品和作用飲料，以此來提高食品的營養(yǎng)價(jià)值，尤其是在嬰幼兒配方奶粉中，牛磺酸起到了促進(jìn)大腦發(fā)育的重要功能[8-10]。在國標(biāo)GB10765《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)嬰兒配方食品》中明確規(guī)定?；撬岬奶砑恿可舷拗禐? mg/100kJ[11]。在歐盟《Commission Directive 2006/141/EC 嬰兒配方食品和較大嬰兒配方食品》和美國的《CFR Title 21-Part107嬰兒配方食品》也有對?；撬岬拿鞔_規(guī)定[12-13]。目前，國內(nèi)外已報(bào)道了許多?；撬岱治龇椒?，但皆有各自的局限性。本文對?；撬岬臋z測方法進(jìn)行詳盡闡述與分析，以期為相關(guān)從業(yè)人員提供一定的理論指導(dǎo)。

1 樣品前處理方法

牛磺酸是一種極性化合物，當(dāng)它在被檢測的物質(zhì)中時(shí)，并不以結(jié)合態(tài)的形式存在，一般用水作為提取試劑完全能夠提取出樣品中的?；撬?，隨即稀釋即可。如果被檢測的樣品中含有太多的大分子蛋白質(zhì)和一些其他的極性干擾物質(zhì)，用水溶解樣品則不能夠完全溶解蛋白分子和極性物質(zhì)，最終形成半乳狀溶液，無法上機(jī)檢測。奶粉樣品中含有的大量蛋白質(zhì)給牛磺酸的檢測分析帶來了困難，所以在分析檢測前要去除樣品中含有的蛋白質(zhì)和極性物質(zhì)[14]。含有蛋白質(zhì)的樣品可以使用有機(jī)溶劑沉淀法和固相萃取法來分離蛋白質(zhì)。固相萃取通過固相色譜柱中的固定相保留樣品中的?；撬?，蛋白質(zhì)流出，從而達(dá)到分離的目的。該方法雖然分離的效果好，但是萃取柱的成本高，分離過程較繁瑣。有機(jī)溶劑沉淀法是一種利用與水互溶的有機(jī)溶劑(如甲醇、乙醇、丙酮等)能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低而沉淀的方法。有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)沉淀的主要原因是加入有機(jī)溶劑使水溶液的介電常數(shù)降低，從而增加了2個(gè)相反電荷基團(tuán)之間的吸引力，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子的聚集和沉淀，其成本較低、方便、快捷。

黃金鳳等[15]在測定嬰幼兒配方奶粉中?；撬釙r(shí)，利用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅作為蛋白沉淀劑沉淀蛋白質(zhì)，回收率在87.5%～102.4%，檢測效果良好。CHEN等[16]對比了乙腈、硫酸鋅、亞鐵氰化鉀與乙酸鋅的混合試劑沉淀嬰幼兒配方奶粉，結(jié)果發(fā)現(xiàn)亞鐵氰化鉀與乙酸鋅的混合試劑效果最好。?；撬岵蝗苡谝译?，會隨著蛋白質(zhì)一同沉淀，硫酸鋅在沉淀含糖量高的樣品時(shí)，效果并不理想。還有學(xué)者利用其他試劑作為蛋白質(zhì)沉淀劑，效果也很好。劉旭輝等[17]利用0.2%的鹽酸和乙醇來沉淀嬰幼兒配方奶粉中的蛋白質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)回收率在99.6%～101.5%，準(zhǔn)確而靈敏。綜上所述，亞鐵氰化鉀，鹽酸、乙醇、乙酸鋅、乙腈等溶液能作為很好的蛋白質(zhì)沉淀劑[18]。

現(xiàn)在大多數(shù)企業(yè)、檢測機(jī)構(gòu)都使用丹磺酰氯柱前衍生法或者是鄰苯二甲醛柱后衍生高效液相色譜法。高效液相色譜丹磺酰氯柱前衍生法原理是?；撬嵩趬A性條件下與丹磺酰氯衍生化反應(yīng)。通過測定衍生物含量來測定?；撬岷俊４朔椒ㄔ诩尤氲せ酋Ｂ热芤汉笠覝乇芄夥磻?yīng)2 h，衍生化反應(yīng)時(shí)間較長，延長了整個(gè)檢測過程的時(shí)間。鄰苯二甲醛柱后衍生高效液相色譜法的原理是?；撬崤c鄰苯二甲醛在堿性條件下生成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)，通過測定衍生物含量來測定?；撬岷?，離子交換柱為鈉離子交換柱，該方法具有靈敏度高，定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但分離所需的鈉離子交換柱價(jià)格昂貴，給測定方法的推廣應(yīng)用帶來了困難。

2 檢測方法

2.1 高效液相色譜檢測方法

近年來，衍生法在高效液相色譜法測定嬰幼兒配方奶粉中的?；撬岷恐械玫搅顺浞值膽?yīng)用，發(fā)展比較快。在采用高效液相色譜法的檢測中，衍生化的目的是將可見強(qiáng)吸收的功能基團(tuán)引入被檢測的對象或是將其轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒庋苌?，來提高檢測的靈敏度，提高對分析樣品的分離和可選擇性[19-20]。選擇不同的衍生化試劑、C18色譜柱、柱前柱后衍生化方法已經(jīng)成為?；撬岬闹饕獧z測方法[21]。?；撬釞z測常用的柱前衍生化試劑有鄰苯二甲醛、異硫氰酸苯酯、丹磺酰氯、9-氯甲酸芴甲酯等。其中，9-氯甲酸芴甲酯與氨基酸衍生反應(yīng)如圖1所示。

圖1 9-氯甲酸芴甲酯與氨基酸反應(yīng)式Fig.1 Reaction formula of 9-chlorofluorene methyl ester and amino acid

王曉鶯等[22]采用9-氯甲酸芴甲酯作為衍生試劑，與奶粉中的?；撬徇M(jìn)行衍生化反應(yīng)，利用反相高效液相色譜法測定奶粉中?；撬岬暮?。以甲醇-0.025 mol/L磷酸鹽緩沖溶液為流動(dòng)相(pH=8.0)，C18柱為分離柱，用二極管陣列檢測器(265 nm)檢測，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.38%，加標(biāo)回收率為82.8%～96.7%，檢出限為46 ng/mL[22]。異硫氰酸苯酯與氨基酸反應(yīng)生成苯氨基硫代甲酰胺的衍生物如圖2所示。

圖2 異硫氰酸苯酯與氨基酸反應(yīng)式Fig.2 Reaction formula between phenyl isothiocyanate and amino acids

趙超敏等[23]采用異硫氰酸苯酯和三乙胺來進(jìn)行衍生化，異硫氰酸苯酯和三乙胺在室溫下衍生反應(yīng)1 h，最后加入正己烷終止衍生化，利用外標(biāo)法進(jìn)行定量。檢測結(jié)果顯示回收率為90%～108%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.16%～2.24%。該方法準(zhǔn)確、可靠，能夠滿足牛磺酸含量的有效確定，特別適用于嬰幼兒配方奶粉中?；撬岷康臋z測。YUAN等采用丹酰氯、9-氯甲酸芴甲酯和鄰苯二甲醛3種不同的衍生化試劑測定嬰幼兒配方奶粉中的?；撬幔Y(jié)果表明3種方法均適合檢測嬰幼兒配方奶粉中的牛磺酸，成本低、準(zhǔn)確度高[24]。綜上所述，高效液相色譜衍生化方法精確度和靈敏度較高，需要衍生化反應(yīng)，耗時(shí)較長，操作復(fù)雜，該方法更適用于對微量、痕量?；撬岬臋z測分析。

2.2 氨基酸分析儀檢測方法

近年來，人們越來越重視檢測分析方法的創(chuàng)新和效率，檢測分析的速度、靈敏度以及儀器的自動(dòng)化程度均已達(dá)到了一個(gè)較高的水平，氨基酸分析儀檢測也發(fā)展成為一種具有廣泛適應(yīng)性的分析方法[25]。氨基酸分析儀不用柱前衍生，直接上樣進(jìn)行分析，操作步驟簡單，是迄今氨基酸定性、定量分析中應(yīng)用最廣泛的方法之一[26]。蒲云月建立了一種用氨基酸自動(dòng)分析儀測定嬰幼兒配方奶粉中含硫氨基酸的的分析方法，利用氧化水解法來處理蛋白質(zhì)，這種方法準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好，分析樣品花費(fèi)時(shí)間少，比較適合大量常規(guī)樣品和未知復(fù)雜樣品中含硫氨基酸的分析檢測[27]。劉常凱等將樣品經(jīng)0.01 mol/L鹽酸溶液溶解，并用106 g/L亞鐵氰化鉀溶液和219 g/L乙酸鋅沉淀蛋白質(zhì)后，經(jīng)過10 000 r/min離心10 min取出上清液，定容后，用氨基酸分析儀鈉系統(tǒng)進(jìn)行程序洗脫，LCA K06/Na色譜柱進(jìn)行分離，茚三酮溶液衍生顯色，在570 nm波長下測得?；撬嵘V峰，用外標(biāo)法定量，在?；撬豳|(zhì)量濃度為5.544～110.880 μg/mL時(shí)有良好的線性關(guān)系(r=1.000 0)，回收率為101.47%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%(n=9)[28]。

氨基酸分析儀法靈敏度與精確度比較高，重現(xiàn)性比較好，氨基酸分析儀檢測法是最常用的方法，其自動(dòng)化程度較高，適合大批量的常規(guī)樣品的檢測。但此方法的選擇性較差，儀器設(shè)備也比較昂貴，給方法的推廣帶來難度。

2.3 液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法

液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用法測定?；撬釙r(shí)不需要衍生化，可直接測定[29]，根據(jù)?；撬針O性和水溶性的特質(zhì)，有大量報(bào)道顯示，色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已經(jīng)用于?；撬岬臋z測。陳稚等利用高效液相色譜與電噴霧電離質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對嬰幼兒配方奶粉中的牛磺酸進(jìn)行分析，結(jié)果線性關(guān)系良好(r=0.999 6～0.999 9，最低定量限10 μg/L)，回收率為99.1%～101.7%[30]。牛磺酸在親水體系中，水作為強(qiáng)洗脫溶液，有機(jī)溶劑具有弱洗脫強(qiáng)度，能起到增加有機(jī)相比例的作用，提高在質(zhì)譜中的揮發(fā)性，改善分離度。ZHANG等建立了高效液相色譜-四極/靜電場高分辨質(zhì)譜法測定奶粉中?；撬岬姆椒?，并采用該方法的正離子模式分析和同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，結(jié)果表明，內(nèi)標(biāo)法測定?；撬峋€性關(guān)系為0.5～10 μg/L(r=0.999 8)，檢測限為0.2 μg/kg，3個(gè)級別(2、5、10 μg/kg)?；撬岬幕厥章蕪?9.9%降至94.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.7%～6.9%(n=5)[31]。該法準(zhǔn)確、簡便、快速，精密度、準(zhǔn)確度、靈敏度均能滿足嬰幼兒配方奶粉中?；撬岬臏y定要求。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法不僅操作簡單，檢測時(shí)間也較其他方法大大縮短。CHEN等采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)直接測定嬰幼兒配方奶粉中?；撬岬暮?，采用外標(biāo)法定量，整個(gè)分析過程8 min即可完成，方法的回收率為72%～97%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.16%～3.33%[32]，方法簡便、快速、低基質(zhì)效應(yīng)、靈敏。

液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法檢測奶粉中的?；撬崮軌蜻_(dá)到歐盟及我國乳粉中?；撬岬臋z測要求，其操作簡單，精密度、靈敏度高，分離能力好，選擇性高，樣品無需衍生化，適用于對檢測含量有嚴(yán)格要求的微量和痕量檢測。

2.4 毛細(xì)管電泳檢測方法

毛細(xì)管電泳法可以測定一些復(fù)雜生物基質(zhì)中的?；撬?，可用于檢測嬰幼兒配方奶粉中游離的?；撬?，具有簡單、高效、準(zhǔn)確、成本低等特點(diǎn)，在氨基酸的分離和分析中得到較為廣泛的應(yīng)用，但應(yīng)用于?；撬釞z測的報(bào)道較少。毛細(xì)管電泳法是根據(jù)氨基酸不同的電離方式基礎(chǔ)上進(jìn)行氨基酸分離[33]，雖然該方法具有分離效率高，試劑消耗少，不需要梯度洗脫的特點(diǎn)，但較少用于比較復(fù)雜生物基質(zhì)中的?；撬釡y定[34]。KLAMPFL等采毛細(xì)管電泳-電噴霧質(zhì)譜法測定嬰幼兒食品中游離氨基酸，該方法的靈敏度和線性度足以在一次運(yùn)行中分析所有感興趣的溶質(zhì)[35]。權(quán)菲菲研究表明，毛細(xì)管電泳是以毛細(xì)管為分離通道，高壓直流電場為驅(qū)動(dòng)力的液相分離技術(shù)，分離分析效率高，試劑和樣品消耗少,它是發(fā)展較快的分離分析技術(shù)之一[36]。電容耦合非接觸式電導(dǎo)檢測利用緩沖液與樣品之間的電導(dǎo)差別進(jìn)行檢測，比較適合分析檢測光學(xué)吸收弱和無光學(xué)吸收的化合物。毛細(xì)管電泳-電容耦合非接觸式電導(dǎo)檢測法檢測技術(shù)成功應(yīng)用于毛細(xì)管電泳中，成為一種很有潛力的檢測器[37]。

2.5 其他檢測方法

薄層色譜法操作便捷，不需要昂貴的儀器和特殊的試劑，適合在基層推廣使用，樣品?；撬峤?jīng)過離子交換柱，被提純后經(jīng)薄層色譜法定性、定量。此方法靈敏度低，因受到薄層厚度、薄層板制備、點(diǎn)樣技術(shù)等條件難以保持恒定，定量的準(zhǔn)確性不夠穩(wěn)定[38]。氣相色譜法測定?；撬嵋约鞍被嵋呀?jīng)得到了廣泛應(yīng)用，氣相色譜法的準(zhǔn)確度和靈敏度都較好，但樣品在衍生化方面的要求較高，利用磺酸基生成揮發(fā)性的衍生物進(jìn)行測定[38]。分光光度法準(zhǔn)確度和靈敏度都低，設(shè)備廉價(jià)，操作方便快捷，但是試劑毒性大，只能檢測出一種或一類氨基酸的總量，用于氨基酸的總量測定[39]。紅外光譜分析法準(zhǔn)確度和靈敏度都比較高，快速無損、環(huán)保無污染，但是需要結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)方法建立定量分析模型才能很好地應(yīng)用[40]。

目前，能夠檢測嬰幼兒配方奶粉中?；撬峥尚械姆椒ㄓ泻芏?，主要方法比較如表1所示。

表1 嬰幼兒配方奶粉中?；撬峥尚械臋z測方法Table 1 A feasible method for the detection of taurine in infant formula

由表1可知，嬰幼兒配方奶粉中?；撬峥尚械臋z測方法均有其特點(diǎn)及局限性。目前液相色譜檢測方法適合檢測少量樣品，氨基酸分析儀檢測方法適合單個(gè)種類的分析物，液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法適合測定大批量樣品，毛細(xì)管電泳檢測方法適合檢測生物基質(zhì)簡單的樣品，薄層色譜法適合不需要精準(zhǔn)定量的樣品，分光光度法適合檢測某一類氨基酸總量的檢測，紅外光譜分析法適合測定不含水的樣品，多用于定性分析。

3 結(jié)語

牛磺酸在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用，?；撬峥焖佟踩臋z測分析方法一直都是從業(yè)者研究的熱點(diǎn)，尤其是對于嬰幼兒配方奶粉中?；撬岬臋z測，關(guān)乎嬰幼兒的營養(yǎng)健康問題。氨基酸自動(dòng)分析法已經(jīng)成功應(yīng)用于?；撬岬臋z測分析，但仍存在一定局限性；液相色譜法是目前檢測嬰幼兒配方奶粉中牛磺酸實(shí)際應(yīng)用最多的一種方法，主要受到衍生物的穩(wěn)定性、分析時(shí)間、反應(yīng)副產(chǎn)物等因素的影響，該方法需要在高靈敏度和特異性的新衍生化試劑開發(fā)方面做進(jìn)一步的研究。隨著新儀器、新技術(shù)的廣泛應(yīng)用，不需要衍生化、能直接對?；撬徇M(jìn)行測定的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)將成為嬰幼兒配方奶粉中牛磺酸檢測分析的主要方法，得到廣泛的應(yīng)用。