利用16S rDNA分析不同地區傳統發酵泡菜的細菌多樣性

劉巧，羅強，張明，生龍娜雍，關仁梅，羅璠*

1(西南民族大學 生命科學與技術學院，四川 成都，610041)2(青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室(西南民族大學)，四川 成都，610041)

泡菜是以新鮮蔬菜為原料，經過一定濃度鹽水腌漬，由優勢菌群乳酸菌以厭氧主導發酵而成的蔬菜食品[1]。中國泡菜有著悠久的歷史，在3千多年前的商周時期家家戶戶就開始制作和食用,數千年來流傳廣泛，延續至今，是珍貴的中國優良傳統發酵食品。泡菜不僅質地鮮嫩，香脆爽口，而且含有大量的膳食纖維、維生素、抗酸化活性因子以及益生菌等，能夠幫助機體排毒，促進身體新陳代謝，延緩肌膚衰老，利于胃腸道消化。

研究傳統發酵泡菜中微生物多樣性的主要方法是可培養和免培養。可培養方法即采用傳統分離純化鑒定的方法，例如黨喬等[2]通過MRS培養基分離和16S rDNA測序，從不同廠家生產的泡菜中分離篩選出34株乳酸菌，并分析其種類和數量。劉境等[3]采用分離純化方法在自然發酵錦州小菜中篩選得到24株疑似乳酸菌，通過16S rDNA序列分析對24株菌進行鑒定。由于傳統純培養技術只能獲得環境中微生物總量的極少部分，因此對于展現環境中微生物的多樣性存在很大的片面性[4]。隨著分子生物學技術的迅速發展，通過直接提取環境微生物基因組DNA的方法，可以從分子水平上全面解釋系統中微生物的多樣性和群落結構。如陳希等[5]采用建立16S rDNA克隆文庫的方法，對不同腌制階段雪菜的細菌多樣性以及相關指標的變化情況進行了研究。曹碧璇等[6]利用構建16S rRNA基因文庫的方法,研究了東北自然發酵酸菜中的細菌多樣性和群落的組成結構。CHANG等[7]運用變性梯度凝膠電泳(polymerase chain reaction denaturing gradient gel electrop-hores，PCR-DGGE)技術，對不同類型泡菜發酵過程中的細菌、古菌和酵母的動態變化進行了研究。應用這些方法可以更加清晰地了解泡菜中微生物的多樣性和菌群結構，避免了傳統純培養方法獲取微生物信息的局限性。因此，本研究基于發酵泡菜地區差異的因素，構建16S rDNA克隆文庫對吉林、河南、遼寧、內蒙古4個地區發酵泡菜的細菌多樣性和群落的組成結構進行研究，探討不同地區發酵泡菜中微生物多樣性的異同之處，以便確切了解不同地區泡菜中的微生物資源分布和泡菜發酵機理。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品分別取自吉林(JL)、河南(HN)、遼寧(LN)和內蒙古(NMG)4個地區當地傳統的自然發酵農家泡菜液,密封保存于-20 ℃備用。

1.2 試劑

2×Tap 聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR) Master Mix、TE緩沖液(pH=8.0)，索萊寶科技有限公司；SuperRed/GelRed核酸染色劑、引物Eu27F、1490R，上海生工生物工程有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、PCR純化試劑盒，江蘇科晶生物科技有限公司；DH5α-感受態細胞、TIANGEN、pGM-T克隆試劑盒，上海康朗生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。

1.3 儀器與設備

ST16R高速冷凍離心機，賽默飛世爾有限公司；T100PCR儀，深圳瑞華希科技有限公司；R40-IIB2超凈工作臺，上海蘇凈實業有限公司；Tanon3500凝膠成像系統，上海天能科技有限公司；GI54DW高壓蒸汽滅菌鍋，廈門致微儀器有限公司；DYCP-31DN水平電泳儀，南京庚辰科學儀器有限公司； GH6000電熱恒溫培養箱，天津泰斯特設備有限公司；NanoDrop2000微量核酸測定儀，上海學靜生物科技有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 細菌基因組DNA提取

用細菌組DNA提取試劑盒提取泡菜液中的細菌DNA，按照試劑盒說明書進行具體操作。

1.4.2 細菌16S rDNA的PCR擴增

擴增引物：Eu27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1490R：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′[8]。PCR擴增反應體系(25 μL)：模板DNA 1 μL(100 ng/μL)，上下游引物各2 μL(10 pmol/μL)，2×Tap PCR Master Mix 12.5 μL，無菌雙蒸水7.5 μL。PCR擴增反應程序：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸70 s，循環30次,72 ℃延伸20 min后反應結束，4 ℃保溫備用[9]。

1.4.3 克隆文庫的構建

經純化后的PCR產物，通過pGM-T克隆試劑盒與pGM-T載體進行連接，連接產物轉化入E.coliDH5α-感受態細胞中，并在Amp-X-gal-IPTG抗性篩選培養基上進行藍白斑篩選，挑選具有氨芐青霉素抗性的白色菌落。再通過菌液PCR檢測篩選正確的陽性克隆子，然后建立16S rDNA克隆文庫。每個地區泡菜樣品中隨機挑選50個陽性克隆菌液送上海生工生物工程有限公司測序。

1.4.4 16S rDNA序列分析和系統發育分析

將200個陽性克隆子進行測序后，用軟件UCHIME對所測得的16S rDNA序列進行嵌合體識別，檢查有無異常序列后再利用GeneBank的BLAST程序進行同源性比對選擇相似度最高的16S rDNA序列。使用CLASSIFIER(RDP II)對所測序列進行分類[10]。用軟件BioEdit將所有序列以相似性≥97%劃分為1個操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)[11]。使用MAGA 5.0軟件通過Neighbor-Joining法構建系統發育樹[12]，并用Bootstrap(1 000次) 檢驗發育樹的置信度。

1.4.5 細菌群落多樣性分析

文庫的覆蓋率可以反映所建文庫對系統中細菌多樣性的表現程度。采用覆蓋率Coverage C評估泡菜細菌克隆文庫的庫容情況,如公式(1)所示：

Coverage C/%=[1-(n1×N-1)]×100

(1)

式中:n1代表文庫中只出現1次的克隆子數目，N代表文庫中克隆子總數[13]。

微生物多樣性和均勻度指數顯示群落中種類多寡及菌株分布等情況，采用4個指標即shannon指數，simpson優勢度，pielou均勻度，sorensen similarity相似度指數評價泡菜樣品細菌群落的多樣性，以上均采用R語言中vegan及biodiversity r包進行統計分析并繪制稀釋曲線(rarefaction curve)。根據不同地區泡菜樣品的共同OTU數目和單獨OTU數目，繪制維恩圖，并結合菌群組成柱狀圖和熱圖分析菌群的群落結構多樣性。

2 結果與分析

2.1 克隆文庫評價

本研究根據樣品的OTU數據結果，做出吉林、河南、遼寧、內蒙古4個地區泡菜樣品的稀釋曲線，如圖1所示。隨著每個地區泡菜細菌的克隆子數目增加，OTU數目逐漸增加, rarefaction曲線逐漸上升趨于平坦，這說明所測序的克隆數能夠反映克隆構建文庫中的細菌多樣性，可以囊括泡菜樣品中大多數的菌落。并且4個地區的細菌克隆文庫的覆蓋率均較高，依次為92%、94%、86%、92%，這也表明克隆文庫的庫容已足夠，能夠較完整地反映細菌群落多樣性。

圖1 細菌16S rDNA克隆文庫稀釋曲線Fig.1 Rarefaction analysis of bacteria 16S rDNA clone library

2.2 細菌群落OTU分布

經分析將200條合格序列按照97%序列相似性共劃分為9個OTU。采用R語言工具統計并繪制OTU分布維恩圖，可以直觀展現4個地區發酵泡菜菌群在OTU構成上的相似性、特異性和交疊情況。結果如圖2所示，吉林、河南、遼寧、內蒙古4個地區泡菜的OTU數目存在差異，分別為4、3、7、4個OTU，其中遼寧地區的OTU數目最多，河南地區的OTU數目最少。同時這4個地區的細菌群落組成有重疊，說明它們之間均存在共同的群落，其中4個地區中共有的細菌OTU數目為2。兩兩地區間也存在共同的OTU，吉林和內蒙古共有的細菌OTU數量為4；遼寧和河南共有的細菌OTU數目為3。另外在遼寧地區中特異性細菌OTU數目為4，而其他3個地區沒有特異性細菌OTU，這說明遼寧地區泡菜的細菌群落結構多樣，細菌群落組成特異性在這4個地區中最大。

圖2 不同地區發酵泡菜OTU維恩圖譜Fig.2 OTU Venn diagram of fermented pickles in different regions

2.3 多樣性指數及相似度分析

不同地區泡菜的細菌多樣性見表1，遼寧地區和吉林地區的多樣性指數分別為1.555和1.015，說明這兩個地區泡菜的細菌群落具有較高的多樣性，并且遼寧地區的細菌群落具有更為豐富的多樣性，而河南和內蒙古地區的多樣性指數分別為0.43和0.5，泡菜的細菌群落多樣性相對較低。同時，除河南地區的其他3個地區泡菜的均勻度指數相差不大，為0.549～0.69，但河南地區泡菜的均勻度指數很低為0.384，說明河南地區泡菜的細菌種群的分布很不均勻。另外，相似系數顯示了遼寧地區和其他3個地區的泡菜相似性較平均，均在0.5以上，而內蒙古和河南地區的泡菜之間的細菌相似度最差，相似系數僅為0.12。

表1 不同地區泡菜細菌的多樣性指數和相似性Table 1 The diversity index and similarity index of pickles bacteria with different regions

2.4 不同地區泡菜的菌群分布及主要優勢菌

本研究中200條克隆子序列經CLASSIFIER進行分類后，顯示這些克隆子均為乳酸菌，屬于硬壁菌門，并且分布于乳桿菌屬(Lactobacillus)(83%)，腸球菌屬(Enterococcus)(15.5%)，明串珠菌屬(Leuconostoc)(1%)以及片球菌屬(Pediococcus)(0.5%)。將所有序列在NCBI上和GeneBank數據庫中的已知序列進行比對，根據比對結果得到不同地區泡菜的細菌群落結構組成,如圖3所示。

圖3 不同地區泡菜的細菌16S rDNA克隆文庫克隆子分布圖Fig.3 Distribution map of the clones in the bacteria 16S rDNA clone libraries of pickle with different regions

STACKBRANDT等[14]認為16S rDNA基因序列同源性≥97%的菌株可以看作一個種。而對于基因序列高度相似的Enterococcus屬只鑒定至屬水平，因此在其余169個菌株中，129個(64.5%)經鑒定為短乳桿菌(Lactobacillusbrevis),17個(8.5%)為沙克酸乳桿菌(Lactobacillussakei),10個(5%)為棒狀乳桿菌(Lactobacilluscoryniformis)，5個(2.5%)為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，4個(2%)為戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)，2個(1%)為腸系膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)，1個(0.5%)為Pediococcussiamensis，1個(0.5%)為彎曲乳酸桿菌(Lactobacilluscurvatus)。圖3表明所有菌種在4個地區泡菜中呈現不均衡分布，在內蒙古和河南的泡菜中，L.brevis占了絕對的優勢，是最優勢菌群，分別占克隆文庫比例為90%和86%；同樣在吉林和遼寧，L.brevis所占的比例相對較大，為主要優勢菌群，所占比例分別為46%、36%；而遼寧泡菜的主要優勢菌群還有L.sakei和L.coryniformis，分別占克隆文庫比例為26%和20%。從整體上來看Lactobacillus在4個地區泡菜微生物中均占據了絕大部分，根據以往的研究表明，泡菜中的乳酸菌大多數來自于Lactobacillus屬，這與本研究結果相符。田偉等[15]通過構建16S rRNA基因文庫，對四川發酵泡菜中的菌落組成進行分析，所分析的克隆子主要分布于Lactobacillus屬和Pediococcus屬，且Lactobacillus屬占主導。武俊瑞等[16]運用PCR-DGGE 技術從東北發酵酸菜中分離和鑒定出Lactobacillus屬的9個種。張先琴等[17]通過PCR和PCR-DGGE技術,分析四川家庭制作泡菜中的細菌群落結構，結果顯示其中的Lactobacillus屬是優勢種群。而針對4個地區泡菜中均占據一定比例的Enterococcus屬，在以前的研究中也有報道過[18-19]。

2.5 不同地區泡菜的微生物群落結構的差異比較

Heatmap圖可以用顏色深淺度來反映樣本間或物種豐度相似性聚類[20]，將聚類結果展示在Heatmap圖上采用R語言vegan包進行距離計算和聚類分析；得到4個地區泡菜細菌群落及其分類水平Heatmap圖，如圖4所示，圖中每一行代表不同的種，不同的顏色代表不同的豐度，圖中顏色越接近紅色，表示在對應地區泡菜中的菌種豐度越大。反之，顏色越接近藍色則物種豐度越小。由圖4可知，不同細菌物種在各地區泡菜中所占豐度不同，其中L.pentosus在吉林和內蒙古地區泡菜中豐度較高；L.brevis在河南和內蒙古地區泡菜中豐度較高；Enterococcus屬和L.plantarum在吉林地區的泡菜中豐度較高，但遼寧泡菜的細菌菌種比較多，也是各地區菌種差異的主要來源，主要集中于L.coryniformis，Leu.mesenteroides，L.curvatus，Ped.siamensis。而在吉林，河南和內蒙古地區的泡菜中細菌菌種較少，微生物種類多樣性相對較低，這說明不同地區泡菜的細菌群落結構存在差異。

圖4 不同地區泡菜的微生物多樣性Heatmap圖Fig.4 Heatmap analysis of microbiological diversity in pickles with different regions

2.6 系統發育分析

由于Lactobacillus屬在4個地區泡菜細菌中占據絕大部分，因此這里只針對Lactobacillus屬進行系統發育分析。選擇本研究中Lactobacillus屬的部分代表序列和NCBI數據庫中的已知菌株序列建立系統發育樹。結果如圖5所示，在系統發育樹中所有菌株被劃分在4個分支，CD18112100961和CD18112100941與L.coryniformis在同一分支，相似性分別為98%，99%。CD18112100902，CD18112100911，CD18112100963與L.curvatus和L.sakei在一個分支，其中CD18112100963與L.sakei的相似性為99%，其余2株與L.curvatus相似度分別是96%、98%。CD18071300657、CD18101301379、CD18101301341與L.plantarum和L.pentosus聚為1個分支，CD18071300657和L.plantarum有97%的相似性，CD18101301379、CD18101301341與L.pentosus的相似性分別為98%，99%。CD18071300538、CD18112 100951、CD18071300677、CD18071300625、CD180713 00620、CD18071300646、CD18112100925和CD180713 00621都與L.brevis在同一分支，其中除了CD181121 00951和CD18071300538與L.brevis的相似性為96%，其他菌株的相似度均在97%～99%。另外，從4個地區泡菜中共有的菌種L.brevis來看出現了很多分支，說明來自不同地區的同一菌種在進化關系上也出現了差異，這可能是不同地域環境因素造成的。而來自同一地區屬于同一物種的菌株之間在進化上也有差別，這可能和同一地區中不同泡菜樣品的來源有關。

圖5 根據16S rDNA序列構建的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences

3 討論

本實驗以不同地區傳統發酵泡菜為研究對象，采用構建克隆文庫的方法，對克隆子的16S rDNA序列進行測序，在此基礎上研究自然發酵泡菜液微生物群落組成及其多樣性。盡管利用該技術不能反映樣品中所有的細菌類群，但該方法可以反映樣品中的優勢細菌類群[21]。通過構建16S rDNA基因文庫，所分析的200個克隆子分布于Lactobacillus屬，Enterococcus屬，Leuconostoc屬以及Pediococcus屬。其中Lactobacillus屬在數量上占有絕對優勢，是4個地區泡菜共有的主要優勢菌屬，這種現象與多數研究結果相似。一般情況下，在泡菜發酵初期，微厭氧、酸耐受性弱的乳酸菌如Leuconostoc屬的Leu.mesenteroides較多，隨著泡菜的不斷發酵，乳酸逐漸積累，O2逐漸匱乏，此時酸耐受性強、嚴格厭氧的乳酸菌如Lactobacillus屬的L.sakei、L.plantarum等逐漸占據優勢[22]。王秋霞等[23]發現在泡菜發酵初期以乳球菌為主，其中Leu.mesenteroides等是主要的微生物類型，而在泡菜發酵中后期，以乳桿菌如L.plantarum、L.brevis和Lactobacilluscasei等為主。XIONG等[24]證實在泡菜發酵啟動階段Leu.mesenteroidessubsp.先占主導，然后逐步由Lactococcuslactis、Enterococcusfaecalis替換，最后由L.casei和L.plantarum完成發酵。同時有研究表明成熟泡菜中優良菌株的篩選結果大多數來自于Lactobacillus屬[25-27]，優良的理化特性(如耐酸耐膽鹽)不僅使Lactobacillus屬在泡菜菌群中占據優勢地位，而且在泡菜發酵過程中起著一定作用，是衡量泡菜發酵過程的指標。目前，根據我國不同傳統發酵蔬菜的細菌多樣性研究現狀，雖然不同地域具有不同的代表性發酵蔬菜，但L.brevis、L.plantarum、Leu.mesenteroides等都是發酵蔬菜中常見的微生物[28-29]。本研究結果也表明，L.brevis是4個地區泡菜樣品中的優勢菌種，同時在遼寧地區泡菜中的主要優勢菌群還有L.sakei和L.coryniformis，這些和其他的報道有一定差別。烏日娜等[30]通過PCR和PCR-DGGE技術，對發酵進程中酸菜的細菌群落動態變化進行分析，發現在酸菜發酵前期Leuconostocsp.為優勢菌群, 在發酵中后期L.plantarum為優勢菌群。張蓓蓓等[31]在180多份泡菜中分離出447株乳酸菌，經鑒定分布于11個屬34個種，并確定了Leu.mesenteroides、L.brevis、L.plantarum等為主要優勢菌群。并且，本研究中除了Ped.siamensis，其余菌種在以前的研究中都有報道過[32-34]。

量化的多樣性指數可以反映泡菜發酵過程中微生物群落結構的演替變化規律，本研究中多樣性指數分析說明，遼寧和吉林地區泡菜的細菌多樣性較豐富，但遼寧泡菜的細菌多樣性相對高些，其主要原因是遼寧泡菜所特有的菌群L.coryniformis、Leu.mesenteroides、L.curvatus、Ped.siamensis也占據了一定的比例，使得遼寧泡菜的細菌多樣性較高以及呈現出與其他3個地區泡菜的差異性。而內蒙古和河南地區泡菜的細菌群落多樣性相對較低，原因在于細菌群落結構相對單一。4個地區泡菜的細菌群落分布不同，微生物多樣性存在差異，究其原因，泡菜發酵是一個復雜的發酵體系，微生物種類繁多，不同的外部因素如氣候、地域、原輔料、發酵方法等均能夠影響發酵泡菜的微生物群落結構[35]，從而也導致泡菜的口感、風味、營養的差異。

4 結論

本研究通過構建16S rDNA克隆文庫方法對吉林、河南、遼寧、內蒙古4個地區傳統發酵泡菜的細菌群落多樣性進行研究，從4個地區泡菜樣品中隨機挑取200個克隆子，經16S rDNA基因序列鑒定所得克隆子可分為4個屬，其中Lactobacillus屬6個種占據了絕對比例，Enterococcus屬均占4個地區泡菜細菌的一定比例，另外在遼寧地區泡菜中還有Leu.mesenteroides和Ped.siamensis，因此遼寧地區泡菜的細菌種類數最多，而河南地區泡菜的細菌群落較為單一，但在4個地區泡菜中優勢菌種均為L.brevis。多樣性指數分析表明不同地區泡菜的菌株種類、優勢度、均勻度存在差異，遼寧地區泡菜的種類較豐富，優勢屬突出，且分布均勻，而河南地區泡菜的多樣性、優勢度和均勻度較低，并且除遼寧地區泡菜外，其他3個地區之間的菌落相似度均較低。由于本研究只構建了4個地區泡菜的細菌16S rDNA克隆文庫，沒有研究泡菜液中其他微生物類群，因此需要進一步探討。本研究通過比較分析不同地區泡菜的細菌多樣性，可為后續深入研究泡菜發酵原理、風味物質的合成機制提供一定的理論依據，對優化泡菜發酵條件和開發利用泡菜微生物資源具有重要的研究意義。