綿羊HTR4基因的生物信息學分析

劉佳 王禎 代友超 張小雪

摘要：利用生物信息學數據庫及軟件，對綿羊羥色胺受體4基因（hydroxytryptamine receptor 4，HTR4）進行生物信息學分析，以初步了解其結構并進行功能預測。結果表明，綿羊HTR4基因所含最大長度的開放閱讀框為1 317 bp，編碼438個氨基酸殘基。HTR4基因編碼的蛋白分子質量為49 437.09 KDa，理論等電點（pI）為8.32。亞細胞定位結果表明其編碼產物主要定位于質膜（60.9%），且不屬于分泌蛋白。HTR4蛋白不存在信號肽序列，存在7段跨膜結構且無低復雜性段區域，該蛋白的二級結構以α螺旋為主，且三級結構主要由α折疊纏繞形成。

關鍵詞：綿羊;HTR4基因;生物信息學分析

中圖分類號：S826? ? ? ?文獻標志碼：A? ? ? ?文章編號：1001-1463（2020）10-0035-06

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2020.10.008

Abstract：The bioinformatics analysis of sheep HTR4 gene was carried out by using bioinformatics database and software， and its structure was preliminarily understood and predicted. The results showed that sheep HTR4 gene contained an open reading frame of 1 317 bp， encoding 438 amino acid residues. The molecular mass of HTR4 protein was 49 437.09 KDa， and the theoretical isoelectric point pI was 8.32. The subcells were mainly located in plasma membrane and did not belong to secretory protein（60.9%）. There are no signal peptide sequences. There are seven segments of transmembrane structure and no segments of low complexity region. The secondary structure is mainly α-helix， and the tertiary structure is mainly formed by α-helix， winding and folding.

Key words：Sheep;HTR4 gene;Bioinformatics analysis

5-羥色胺（5-hydroxytryptamine， 5-HT）既是一種神經遞質，又是一種血管活性物質，在中樞神經系統和外周組織中起著多種生理作用[1 ]。HTR4是其受體一亞型，HTR4 基因在人體內定位于5q31-33， 編碼羥色胺受體4 型蛋白[2 ]。該基因在人和鼠的中樞神經系統和外周組織中都有廣泛的表達，但在不同的組織中表達量差異顯著，主要分布在腦組織和腸道組織中，在人類中樞神經系統所有組織中都有表達，其中腦組織的表達率顯著高于外周組織[3 ]。外周組織中，小腸的表達率最高，參與胃腸道的運動與分泌、調節蠕動反射及影響腸道感覺功能[4 ]。HTR4參與胃腸道的運動與分泌、調節蠕動反射及影響腸道感覺功能[5 ]。外周HTR4的作用首先是在豚鼠體內發現的。在用電刺激豚鼠腸縱行平滑肌叢時，HT作用于一個在藥理學上與HTR4類似的受體，從而增強膽堿能介導的收縮。其在人和鼠的中樞神經系統和外周組織中都有廣泛的表達，但不同組織內的表達量卻有顯著差異，其主要分布在腦組織和胃腸道組織中。

生物信息學是利用數學方法處理和分析生物數據，基于人們現有對分子生物學的認識和構建生物模型，進而分析其生物學特性的方法[6 ]。對HTR4基因的研究大多為人類HTR4基因及其編碼產物的功能，而綿羊HTR4基因方面的研究不足。本研究以生物基因組數據庫調取的綿羊HTR4的序列為基礎，利用生物信息學方法對綿羊HTR4基因及其編碼產物的理化性質、序列特征、蛋白質結構以及生物學功能進行預測和分析，以期為深入研究HTR4基因及其編碼蛋白的基本結構和生物學功能提供理論基礎。

1? ?材料與方法

1.1? ?序列來源

數據來源于NCBI網站GenBank數據庫，包括綿羊（XM_027970630.1）、狗（XM_ 022417831.1）、雞（XM_015293658.2）、馬（NM_ 001163982.1）、貓（XM_023260627.1）、牛（NM_001040485.1）、兔（XM_008255221.2）、豚鼠（NM_001172963.1）、豬（NM_001001267.1）、人（NM_000870.7）和山羊（XM_018050181. 1）等11個物種的mRNA序列。括號內為GenBank登錄號。

1.2? ?方法

綿羊HTR4基因開放閱讀框（Open reading frame，ORF）采用NCBI的ORF Finder程序分析，參照Kozak法則[7 ];HTR4基因編碼產物的理化性質采用Bioedit及ExPASy分析軟件預測;亞細胞定位采用PSORTⅡ預測[8 ]。蛋白潛在信號肽剪切位點預測采用Signalp 3.0軟件。跨膜螺旋區域的預測采用TMHMM程序。蛋白保守結構域分析采用Smart軟件。采用Prot Scale進行蛋白親疏水性分析。二級結構采用Jpred分析預測。采用Swiss-model軟件分析蛋白三級結構多序列比對及同源性分析采用DNAMAN軟件分析[9 ]。

2? ?結果與分析

2.1? ?綿羊HTR4基因開放閱讀框分析

從開放閱讀框分析結果（圖1）可以看出，綿羊HTR4基因序列中最大長度的ORF有? 1 317 bp，起始密碼子位于1 bp處，終止密碼子位于1 845 bp處，推測其編碼438個氨基酸殘基。

2.2? ?綿羊HTR4編碼產物的理化性質分析

蛋白質的基本性質包括其相對分子質量、氨基酸組成、等電點基因編碼產物半衰期和不穩定指數等[10 ]。對綿羊HTR4基因編碼產物理化性質的分析結果表明，綿羊的HTR4基因編碼438個氨基酸殘基，其分子式為C2253H3497N577O605S34，分子質量為49 437.09 KDa，理論等電點pI為8.32。其氨基酸組成如圖2所示，其中含量最多的是Leu（亮氨酸），所占比例為10.27%;含量最少的是His（組氨酸），所占比例為1.83%。負電荷殘基總數（Asp+Glu）為32，正電荷殘基總數（Arg+Lys）為37。基因編碼產物半衰期和不穩定指數分別為30 h和51.70，不穩定指數為41.57 > 40.00，由此可確定綿羊HTR4基因編碼產物屬不穩定蛋白。

2.3? ?綿羊HTR4蛋白亞細胞定位

從綿羊HTR4基因編碼蛋白的亞細胞定位結果（表1）可以看出，綿羊HTR4蛋白分布于質膜的可能性為60.9%，分布于囊泡分泌系統的可能性為17.4%，分布于內質網的可能性為8.7%，分布于細胞核和線粒體的可能性均為4.3%。由此推斷，綿羊HTR4基因主要在質膜中發揮生物學作用，其次在囊泡分泌系統中發揮作用。

2.4? ?綿羊HTR4編碼產物的同源性比對及系統發育分析

HTR4基因在多個物種中都有表達。采用DNAMAN對兔、牛、綿羊、山羊、貓、馬、人、豚鼠、豬、狗和雞HTR4蛋白多序列比對的結果如圖3所示，可以看出，HTR4基因在這11個物種中均有表達，且綿羊與牛和山羊的HTR4氨基酸序列同源性較高，這也說明了它們在進化過程具有較近的親緣關系。HTR4編碼產物同源樹證明，在分析中選取的11個物種中，綿羊、山羊和牛的同源性最高（圖4）。

2.5? ?綿羊HTR4蛋白潛在信號肽剪切位點預測

信號肽序列是存在于分泌蛋白基因編碼序列中、在起始密碼子之后的1段富含疏水氨基酸多肽的序列。蛋白質的合成是在核糖體上進行，信號肽是蛋白質的1個片段，引導核糖體并定位于內質網上的一個通道上，使核糖體附著在內質網上，并將不斷伸長的蛋白質鏈穿透通過通道，隨后信號肽被切割下來，合成的蛋白質被釋放進內質網腔，最后被轉運到胞外[11 ]。通過檢測綿羊HTR4蛋白潛在信號肽的存在情況可以得知該基因編的產物是否是分泌蛋白和跨膜蛋白以及跨膜蛋白的基本信息。從圖5可以看出，綿羊HTR4基因編碼產物的C值、Y值和S值分別為0.619、0.058和0.463。因此推斷HTR4基因的編碼產物不存在信號肽，但發現跨膜區，故該蛋白既是非分泌性蛋白又是跨膜蛋白。

2.6? ?綿羊HTR4蛋白跨膜螺旋結構預測

從TMHMM 2.0軟件的分析結果（圖6）可以看出，HTR4基因編碼的蛋白質是跨膜蛋白，該基因編碼的蛋白有7段跨膜區間，分別是145～167、180～202、217～239、259～281、314～336、383～401和416～438。

2.7? ?綿羊HTR4蛋白保守結構域分析

由綿羊HTR4蛋白潛在信號肽剪切位點預測已知綿羊HTR4基因編碼的蛋白是跨膜蛋白，通過Smart軟件分析，綿羊HTR4有7段跨膜結構，分別是72～94、107～129、144～166、186～208、241～263、310～328、343～365（圖7、圖8）。

2.8? ?綿羊HTR4蛋白親疏水性分析

研究發現，該基因編碼蛋白疏水性最大值為2.878（第82位），最小值為-3.078（第384位），由此得出該基因編碼的蛋白屬于親水蛋白（圖9）。

2.9? ?綿羊HTR4蛋白二級結構的預測

二級結構（secondary structure）是指蛋白質第一個水平的折疊，即部分蛋白質鏈折疊形成一些通用結構，這些通用結構在所有蛋白質中都能找到[12 ]。通過Jpred軟件分析可知（圖10）綿羊HTR4蛋白二級結構α螺旋（α-helix，Hh）、β折疊（β-sheet，Ee）和無規卷曲（random coil，Cc）分別有243、9和188段，分別占比55.22%、2.05%和42.73%，可見綿羊HTR4蛋白二級結以α卷曲為主。

2.10? ?綿羊HTR4蛋白三級結構預測與分析

三級結構（tertiary structure）是指蛋白質在二級結構基礎上的進一步折疊，通過將二級結構元素組裝在一起形成每個蛋白質特有的三維構象[12 ]。由圖11可知，HTR4基因編碼蛋白的三級結構主要由α卷曲折疊纏繞形成。

3? ?小結

綿羊HTR4基因的最長ORF長度為? ? ? 1 317 bp，編碼438個氨基酸殘基;亮氨酸所占比例最多，為10.27%，分子質量為49 437.09 KDa，理論等電點（pI）為8.32。HTR4基因編碼的產物為不穩定性蛋白，其亞細胞定位的結果顯示在質膜的可能性最大，為60.9%。HTR4基因編碼產物在多種物種中氨基酸序列高度相似，綿羊與牛、山羊在系統發育樹中距離最近。HTR4基因的編碼產物中不存在信號肽，為非分泌性蛋白但發現了跨膜區，故該蛋白是跨膜蛋白。該基因編碼的蛋白有7段跨膜結構。HTR4基因編碼的蛋白為親水蛋白，富含親水氨基酸。綿羊HTR4基因編碼產物的二級結構主要以α螺旋為主，三級結構主要由α螺旋折疊纏繞形成。

參考文獻：

[1] CICHON S，KESPER K，PROPPING P，et al.? Assignment of the human serotonin 4 receptor gene（HTR4） to the long arm of chromosome 5（5q31-q33）[J].? Molecular? Membrane Biology，1998，15（2）：75-78.

[2] 劉麗波，鞠桂芝，史杰萍，等.? 5-HTR4和GABRG2基因多態性與精神分裂癥關系[J].? 中國公共衛生，2007，23（12）：1461-1463.

[3] 于 平，尹文娟，于 萍.? 5-羥色胺受體對記憶的調節作用[J].? 首都師范大學學報（社會科學版），2009（S4）：141-145.

[4] 李曉麗，吳博威.? 5-羥色胺-4受體激動劑的促腸道動力作用研究[J].? 中國藥物與臨床，2018，18（8）：1279-1281.

[5] 魏蘭福.? 5-羥色胺_4受體對消化道運動的作用及臨床意義[J].? 醫學綜述，2002，8（11）：29-30.

[6] 隋景巍.? 綿羊PTGER3基因生物信息學分析[J].? 鄉村科技，2017，4（11）：52-55.

[7] 羅 軼.? 雞FATP1基因cDNA的克隆、組織表達及其生物信息學分析[D].? 雅安：四川農業大學動物科學技術學院，2008：23-24.

[8] NAKAI KHORTON P.? PSORT：a program for? detecting sorting signals in proteins and predicting their subcellular localization[J].? Trends in Biochemical Sciences，1999，24（1）：34-36.

[9] 張小雪，潘香羽，李發弟，等.? 綿羊ESR基因生物信息學分析[J].? 甘肅農業科技，2014（9）：30-33.

[10] 張小雪，李發弟，王維民.? 綿羊ANXA10基因生物信息學分析[J].? 甘肅農業科技，2016（6）：5-8.

[11] 葉方寅.? 信號肽假說的提出及證實[J].? 國外醫學分子生物學分冊.? 1999，21（6）：377-379.

[12] 孔繁良.? 基于二級結構的蛋白質三級結構預測[D].? 濟南：濟南大學，2016：3-27.

（本文責編：鄭立龍）