基于光干涉原理的生物親和性檢測環境中甾體類激素

吳再輝

摘 要：目的：基于光干涉原理的生物親和性檢測技術，實現甾體類激素動力學參數及定性與定量檢測。方法：利用阻遏蛋白RepA與3α-HSD/CR的回文序列基因及甾體類激素的特異性結合，建立一種非標記光學原理的甾體類激素檢測新方法。結果：檢測了睪丸酮叢毛單胞菌雙鏈DNA OP1與RepA特異親和性，親和常數KD為9.865×10-9M，建立了環境監測中雙鏈DNA OP1與RepA抑制法的甾體類激素總量定量檢測新方法，最低檢測限0.45ng/ml;結論：本文在研究光干涉生物親和性關鍵檢測技術基礎上，建立快速、靈敏、特異的環境監測中甾體類激素總量的新型應用檢測方法，實現甾體類激素的定量檢測，為環境監測領域的生物應用提供新方法。

關鍵詞：光干涉原理;甾體類激素;3α-羥類固醇脫氫酶/碳酰基還原酶（3α-HSD/CR）;阻遏蛋白RepA

生物分子的親和性檢測是指通過實時監測其相互作用過程，獲得分子間是否發生作用，作用強度等信息，揭示微觀生命活動規律的重要方法。該方法具有檢測時間短、精度高、成本低廉等特點，對病毒、細菌及毒素的檢測、臨床用藥篩選等方面有著廣泛的應用[1-3]，是目前檢測領域研究熱點。

甾體類激素在維持生命和調節性功能等方面有著極其重要的作用。人工合成激素類物質能夠模仿生理激素對生物體產生誘導反應，干擾體內代謝信號通路[4]，屬于一類致癌物質[5]。目前，對于環境甾體類激素的檢測主要以液相與質譜等大型進口儀器為主[6，7]，價格昂貴、操作復雜、僅適用于實驗室環境檢測，并且僅能檢測單一組分的已知環境甾體類激素污染物，因此迫切需要建立一種快速、靈敏、高通量、實時、原位檢測環境甾體類激素總量的新方法。

睪丸酮叢毛單胞菌（C.testosteroni，C.T.）ATCC 11996是一種以甾體類激素作為碳源及能源[8，9]的微生物，其中3α-羥類固醇脫氫酶/碳酰基還原酶（3α-HSD/CR）在甾體類激素代謝途徑中發揮至關重要的作用[10，11]。其基因上游含有兩個10bp回文操縱序列[12]，其基因附近還有一個RepA，在沒有甾體類激素時，RepA與回文序列基因相結合，抑制3α-HSD/CR的表達;當有甾體類激素存在時，RepA與甾體類激素特異性結合，構象發生改變，啟動3α-HSD/CR基因的表達功能[13]。

本文將dsDNA固定到SA光纖探針表面，光干涉生物親和性傳感檢測系統實時監測dsDNA與RepA的相互作用曲線，非線性擬合獲得相互作用動力學參數;同時建立dsDNA、RepA與甾體類激素間的抑制檢測法，以最大響應信號與甾體類激素濃度建立定量關系，實現甾體類激素的定量檢測，為環境監測領域的生物應用提供新方法。

1 材料與試劑

睪丸酮標準品，N-月桂酰肌氨酸鈉鹽（SKL）（購自Dr.Ehrenstorfer）;5-Biotin修飾單鏈DNA（ssDNA）片段（上海生工合成）;阻遏蛋白RepA原核表達菌株BL21-pET-15b-RepA（實驗室保存）。

2 實驗方法

2.1 RepA的表達與純化

BL21-pET-15b-RepA在110rpm，16℃下進行原核表達，在表達過程中加入終濃度0.5%SKL溶液提取蛋白。采用SDS-PAGE電泳及Bradford方法對純化蛋白進行鑒定及含量測定[14]。

2.2 OP1的合成

分別合成ssDNA上/下游10OD 5末端標記生物素（Biotin）的含有回文序列的OP1，及陰性對照CO片段。并采用退火方法[15]將合成的單鏈互補形成雙鏈DNA（dsDNA）。OP1：5bioin-GCAGCTCGGCCATGTCAAAGCCCAGCGGCCCCGCGCCC;CO：5biotin-GGCCACGGTAAATTTTCCCTAGGGGAATTACATCGTCC

2.3 dsDNA與RepA親和性檢測

采用光干涉生物親和性傳感檢測系統與SA光纖探針，以dsDNA為生物特異性固定分子研究dsDNA在光纖探針表面的最適固定濃度。檢測過程：平衡階段;最適濃度Biotin-dsDNA固定階段;平衡階段;與不同濃度RepA結合反應階段;解離反應階段。以dsDNA CO為陰性對照，以PBS-T緩沖液作為dsDNA與RepA蛋白稀釋液、空白對照、平衡階段及解離階段溶液。所有溶液均吸取200μl置于黑色微孔板內，1000rpm混勻，恒溫30℃。

2.4 dsDNA與RepA蛋白抑制法甾體類激素定量檢測新方法

以不同濃度睪丸酮標準品與20μg/ml RepA提前孵育，封閉RepA的激素結合位點，使其DNA結合位點構象改變。方法見2.3。

2.5 方法學可行性對比

采集吉林省內某養殖魚塘水樣，采用氯仿粗提法提取水樣中的甾體類激素，然后分別采用HPLC方法、非細胞體系高效生物化學發光傳感器方法[16]及本文建立方法對魚塘水樣中睪丸酮含量進行檢測，研究方法精密度與準確度。

3 結果

3.1 RepA的鑒定

如圖1所示，表達及純化的RepA蛋白分子量為48kDa，濃度為0.58mg/ml。

3.2 dsDNA在SA光纖探針表面固定的最適濃度

dsDNA OP1在0.125～4μM倍比稀釋濃度范圍內，分別固定于SA光纖探針表面，達到平衡后的光譜響應信號值如圖2所示，最適濃度為1μM時，光纖探針表面dsDNA自組裝達到飽和狀態，光譜響應信號不再變化。

3.3 dsDNA與RepA相互作用動力學參數測定

分別采用8只SA光纖探針固定Biotin-dsDNA OP1，如圖3所示，最大響應信號的相對標準偏差RSD分別為5.76%，說明光纖探針一致性較好。

采用固定有dsDNA OP1 SA光纖探針，檢測dsDNA OP1與RepA的親和性。對每個濃度結合曲線做y=y0+a1-e-kaC+kdt非線性擬合，對解離曲線做y=ae-kd（t-t0）非線性擬合，獲得動力學參數結果如表1所示，結合速率常數ka=1.196×1041/Ms、解離速率常數kd=1.179×10-41/s、親和常數KD=9.865×10-9M。親和常數越小，親和性越高，說明RepA與dsDNA OP1親和性高;RepA與陰性對照dsDNA CO無交叉反應，說明RepA與dsDNA OP1相互作用具有特異性。

3.4 甾體類激素定量檢測新方法

將不同濃度睪丸酮標準品與RepA提前孵育，封閉RepA激素結合位點，改變RepA蛋白構象，從而無法與dsDNA OP1發生特異性結合反應。抑制法檢測甾體類激素反應過程曲線如圖4所示，最大信號響應值與睪丸酮濃度呈負相關。

a：預混溶液中不含睪丸酮的空白對照曲線;b-k：預混溶液中含有終濃度為0.534～546.500ng/ml范圍內倍比稀釋的睪丸酮標準品反應曲線;m：預混溶液中含有終濃度為1093ng/ml的睪丸酮標準品反應曲線。

每濃度重復測定3次，定量檢測標準曲線如圖5所示，檢測時間為24min，睪丸酮標準品在0.534～546.500ng/ml濃度范圍內，標準曲線方程符合Logistic四參數非線性擬合，R2=0.988。空白對照為100μl RepA與100μl PBS-T預混勻孵育，最低檢測限（LOD）為空白對照響應值3SD對應的睪丸酮濃度，經實驗為0450ng/ml，定量限（LOQ）為空白對照響應值10SD對應的睪丸酮濃度，經實驗為2.351ng/ml。

3.5 檢測甾體類激素的方法學對比

通過三種方法對水樣甾體類激素的檢測結果與加標回收實驗結果對比，說明光干涉抑制法在總量檢測方面優于HPLC方法，在檢測方法精密度與準確度方面優于非細胞體系生物化學發光傳感器檢測方法。

4 討論

采用光干涉生物親和性傳感檢測系統及SA光纖探針，檢測睪丸酮叢毛單胞菌（C.testosteroni，C.T.）ATCC 11996中dsDNA OP1與RepA的相互作用動力學參數，其中親和常數KD分別為9.865×10-9M，親和常數越小，親和性越高。利用本文建立的方法與HPLC方法及非細胞體系高效生物化學發光傳感器檢測方法進行對比，結果表明，本文建立的光干涉生物親和性傳感檢測抑制方法在甾體類激素總量的檢測中優于HPLC方法的單一物質檢測;檢測方法加標回收率為9440%～110.14%，相對標準偏差RSD為5.60%～12.65%，說明檢測方法精密度與準確度好;樣品前處理簡單，能夠應用于環境中甾體類激素總量的快速檢測。

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基金項目：家庭助孕用多激素指標定量檢測系統的研制（項目編號：Z171100000417014）