基于PI3K/Akt/GSK3β信號通路的芥子酸抗Aβ1-42致PC12細胞損傷的機制研究

薛迪 劉宇超 賈永明 汪娜 劉學偉

摘 要 目的：基于磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/糖原合成激酶3β（GSK3β）信號通路探討芥子酸（SA）抗β淀粉樣蛋白1-42（Aβ1-42）致PC12細胞損傷的作用機制。方法：將大鼠PC12細胞隨機分為對照組、Aβ組（Aβ1-42 2 μmol/L）、Aβ+SA組（Aβ1-42 2 μmol/L +SA 100 μmol/L）、Aβ+SA+LY組[Aβ1-42 2 μmol/L +SA 100 μmol/L+LY294002（PI3K抑制劑）10 μmol/L]、Aβ+LY組（Aβ1-42 2 μmol/L+LY294002 10 μmol/L）、LY組（LY294002 10 μmol/L）。除對照組、LY組外，其余各組細胞均以Aβ1-42復制損傷模型。培養24 h后，使用顯微鏡觀察各組細胞的形態，采用MTT法檢測各組細胞的存活率;采用Western blotting法檢測各組細胞PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β蛋白的表達情況。結果：與對照組比較，Aβ組細胞數量變少、部分突觸斷裂消失，其存活率以及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β比值均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與Aβ 組比較，Aβ+SA組細胞變圓、突觸變多，其存活率以及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β比值均顯著升高（P<0.05）。與Aβ+SA組比較，Aβ+SA+LY組細胞部分突觸斷裂，其存活率以及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β比值均顯著降低（P<0.05）;Aβ+LY組細胞碎片較多，其存活率雖有下降但差異無統計學意義，且p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β比值亦無明顯變化（P>0.05）。單獨給予 LY294002對PC12細胞的形態、存活率以及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β比值均無顯著影響（P>0.05）。結論：SA可能通過激活PI3K/Akt/GSK-3β信號通路對Aβ1-42誘導的PC12 細胞損傷發揮保護作用。

關鍵詞 芥子酸;β淀粉樣蛋白;磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/糖原合成激酶3β信號通路;PC12細胞

中圖分類號 R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）20-2519-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.20.16

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the mechanism of sinapic acid （SA） against PC12 cell injury induced by Amyloid β1-42 protein （Aβ1-42） based on PI3K/Akt/GSK3β signaling pathway. METHODS： PC12 cells of rats were randomly divided into control group， Aβ group （Aβ1-42 2 μmol/L）， Aβ+SA group （Aβ1-42 2 μmol/L+SA100 μmol/L）， Aβ+SA+LY group [Aβ1-42 2 μmol/L+SA 100? μmol/L+LY294002 （PI3K inhibitor） 10 μmol/L]， Aβ+LY group （Aβ1-42 2 μmol/L+LY294002 10 μmol/L） and LY group （LY294002 10 μmol/L）. Except for control group and LY group， the cells of other groups were replicated the damage model with Aβ1-42. After 24 hours of culture， the morphology of cells was obsened in each group with a microscope， and MTT assay was adopted to determine the cell viability of PC12 cells in each group. Western blotting assay was used to detect the expression of PI3K， p-PI3K， Akt， p-Akt， GSK3β and p-GSK3β in cells of each group. RESULTS： Compared with control group， the number of cells decreased and some synaptic breaks disappeared in Aβ group while cell viability， ratio of p-PI3K/PI3K， p-Akt/Akt and p-GSK3β/GSK3β in? ?Aβ group were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with Aβ group， the cells became round and synapses became more in Aβ+SA group while cell viability， the ratio of p-PI3K/PI3K， p-Akt/Akt and p-GSK3β/GSK3β were increased significantly （P<0.05）. Compared with Aβ+SA group， some synaptic breaks occurred in Aβ+SA+LY group while cell viability， the ratio of p-PI3K/PI3K， p-Akt/Akt and p-GSK3β/GSK3β were decreased significantly （P<0.05）; Aβ+LY group had more cell debris， and the cell viability was decreased， but the difference was not significant， and the ratio of p-PI3K/PI3K， p-Akt/Akt and p-GSK3β/GSK3β had no significant change （P>0.05）; LY294002 alone had no significant effect on morphology， cell viability and the ratio of p-PI3K/PI3K， p-Akt/Akt or p-GSK3β/GSK3β （P>0.05）.? CONCLUSIONS： SA may play a protective role against PC12 cell injury induced by Aβ1-42 through activating PI3K/Akt/GSK-3β.

KEYWORDS? ?Sinapic acid; β-amyloid protein; PI3K/Akt/GSK3β signaling pathway; PC12 cell

阿爾茨海默?。ˋlzheimers disease，AD）是一種以進行性認知功能障礙為主要臨床表現的神經退行性疾病[1]。AD患者的主要病理特征為β淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）沉積形成的老年斑、Tau蛋白過度磷酸化引起的神經原纖維纏結（Neurofibrillarytangles，NFTs）和神經細胞缺失[2]。已有研究顯示，向大鼠腦內注射Aβ后，可引起其記憶障礙及神經損傷;此外，AD患者大腦中也存在Aβ異常沉積和大量的神經細胞損傷，提示Aβ誘導的神經細胞損傷可能為AD發生的重要原因[3-4]。研究表明，Aβ的主要成分Aβ1-42具有神經毒性作用，可致神經細胞損傷，從而引發神經系統發生退行性病變[4-5]。

磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號轉導通路是調控神經細胞分化、存活、凋亡的通路之一，也是調節受損神經細胞修復、促進神經細胞存活的重要信號通路[6]。LY294002是一種能夠阻斷上述信號傳導的蛋白激酶抑制劑，可對細胞中的PI3K信號通路發揮特異性抑制作用，并可抑制PI3K/Akt信號途徑，如抑制Akt磷酸化等，從而對下游靶蛋白的表達進行調節[7]。糖原合成激酶3β（GSK3β）是Akt的重要底物，其活性受Akt的負調節，并與Tau蛋白的過度磷酸化密切相關，同時Aβ的生成和沉積亦能導致Tau蛋白的過度磷酸化[8-9]。已有研究顯示，Aβ的神經毒性與PI3K/Akt/GSK3β信號通路相關[10-11]，因此找到可調節PI3K/Akt/GSK3β信號通路相關位點的靶向藥物以對抗Aβ的神經毒性，可能成為防治AD的有效方法之一。研究發現，芥子酸（Sinapic acid，SA）可減輕Aβ1-42誘導的小鼠海馬體CA1區神經細胞的損傷，使紅藻氨酸引起的小鼠海馬體神經細胞損傷得到改善，并能夠顯著減輕鏈脲佐菌素誘導的大鼠記憶缺陷并抑制神經細胞變性，且呈一定的劑量依賴性[12-13]。基于此，本研究以Aβ1-42誘導大鼠PC12細胞制備AD細胞病理模型，并以LY294002為參照，探討SA的神經細胞保護作用及該作用與PI3K/Akt/GSK3β信號通路的潛在關系，以期為臨床治療AD提供新的思路。

1 材料

1.1 儀器

Series 8000型CO2培養箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）;DL-CJ-2NDII型AIRTECH-超凈工作臺（北京東聯科技有限公司）;M200 PRO型多功能酶標儀（瑞士Tecan公司）;CKX41-A32PH型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）;5804R型離心機（德國Eppendorf公司）;165-8001型電泳儀、1703811型電轉儀、Gel Doc XR型凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）;S11-6-S型恒溫水浴鍋（上海躍進醫療器械有限公司）;LDZH-200KBS型高壓蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）。

1.2 藥品與試劑

SA對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：S30697，純度：≥97%）;Aβ1-42蛋白（北京博奧森生物技術有限公司，批號：bs-0107p）;胎牛血清（美國BI公司，批號：04-007-1A）;RPMI培養基（美國HyClone公司，批號：SH30809.01）;LY294002對照品（美國AbMole公司，批號：15447-36-6，純度：100%）;胰蛋白酶（批號：TB150）、青鏈霉素混合液（100×，批號：P1400）、MTT試劑（批號：M8180）、脫脂奶粉（批號：D8340）均購自北京索萊寶科技有限公司;RIPA細胞裂解液（批號：P0013B）、PMSF蛋白酶抑制劑（100×，批號：P1005）、BCA蛋白濃度試劑盒（100×，批號：P0010S）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（5×，批號：P00151）、特超敏ECL化學發光試劑盒（批號：P0018AS）均購自上海碧云天生物技術有限公司;磷酸酶抑制劑（100×，北京康為世紀生物科技有限公司，批號：CW2383S）;Tween-20、SDS、過硫酸銨（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）、甘氨酸、二甲基亞砜（DMSO）均購自美國Sigma公司;預染蛋白標志物（加拿大Fermentas公司，批號：26616）;小鼠PI3K單克隆抗體（批號：60225-1-Ig）、小鼠Akt單克隆抗體（批號：60203-2-Ig）、兔GSK3β多克隆抗體（批號：15113-1-AP）均購自武漢三鷹生物技術有限公司;兔p-PI3K單克隆抗體（批號：4228）、兔p-Akt單克隆抗體（批號：4060）、兔p-GSK3β 單克隆抗體（批號：9323）購自美國CST公司;小鼠β-actin 單克隆抗體（批號：TA-09）、辣根過氧化物（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗（批號：122826）、HRP標記的山羊抗小鼠IgG二抗（批號：122011）均購自北京中杉金橋生物技術有限公司;其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細胞

大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤細胞PC12由中國科學院上海細胞生物研究所提供。

2 方法

2.1 細胞培養

將PC12細胞接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI培養基中，并置于 37 ℃、5%CO2培養箱中培養（培養條件下同），每 2～3 d 換液1次。

2.2 分組

根據課題組前期MTT試驗結果，確定Aβ1-42的最適濃度為2 μmol/L，SA的濃度為100 μmol/L;根據文獻報道，處理神經細胞時，LY294002的最適濃度為10 μmol/L[14]。將細胞隨機分為對照組、Aβ 組（Aβ1-42 2 μmol/L）、Aβ+SA組（Aβ1-42 2 μmol/L+SA 100 μmol/L）、Aβ+SA+LY組（Aβ1-42 2 μmol/L+SA 100 μmol/L+LY294002 10 μmol/L）、Aβ+LY組（Aβ1-42 2 μmol/L+LY294002 10 μmol/L）、LY組（LY294002 10? μmol/L）。

2.3 PC12細胞的形態觀察和存活率檢測

采用倒置顯微鏡觀察并采用MTT法檢測。收集對數生長期的PC12細胞按5×104個/mL接種至96孔板中，每孔100 mL，按照“2.2”項下方法分組，每組設置6個復孔。繼續培養24 h后，Aβ+SA+LY組、Aβ+LY組、LY組先加入LY294002 10 μmol/L孵育1 h;除對照組和LY組外，其余4組分別加入Aβ1-42 2 μmol/L處理24 h以復制損傷細胞模型;隨后，Aβ+SA組和Aβ+SA+LY組加入SA 100 μmol/L，繼續培養24 h，置于倒置顯微鏡觀察其形態并拍照。每孔加入 MTT溶液（5 mg/mL）10 μL，繼續培養4 h，小心吸去孔內培養液，每孔加入 DMSO 150 μL，低速振蕩10 min，以酶標儀于570 nm波長處檢測吸光度（OD）值，并按如下公式計算細胞存活率：細胞存活率（%）=樣品組OD均值/對照組OD均值×100%。上述試驗重復3次。

2.4 PC12中細胞PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β蛋白表達水平的檢測

采用Western blotting法檢測。收集對數生長期的P12細胞，按“2.3”項下方法分組、造模、給藥。培養24 h后，以2 000 r/min離心10 min收集細胞，加入含胰蛋白酶、磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，于冰上裂解后，以12 000 r/min離心20 min，收集上清液即得細胞總蛋白;采用BCA法測定總蛋白含量，于水浴中煮沸5 min制備所需的變性蛋白樣品;采用10%SDS-PAGE進行恒流電泳（電流：60 mA），在恒壓電（電壓：75 V，時間：2 h）以濕轉法轉膜，于37 ℃下以5%脫脂奶粉封閉 1 h，加入PI3K、Akt、GSK3β一抗（稀釋比例均為1 ∶ 800）和p-PI3K、p-Akt、p-GSK3β一抗（稀釋比例均為1 ∶ 600），于4 ℃孵育過夜;采用三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（TBST）溶液清洗3次，每次 5 min，加入二抗（稀釋比例均為1 ∶ 1 000;HRP標記的山羊抗兔IgG二抗對應GSK3β、p-PI3K、p-Akt、p-GSK3β抗體，HRP標記的山羊抗小鼠IgG二抗對應PI3K、Akt、β-actin抗體），于 37 ℃下反應 1 h，用TBST溶液清洗3次，每次5 min;以ECL顯色后，使用凝膠成像系統曝光成像，采用Image Lab 4.0.1圖像分析軟件檢測蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內參蛋白（β-actin）條帶灰度值的比值來表示其相對表達量，并以p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β的比值表示PI3K、Akt、GSK3β蛋白的磷酸化水平。上述試驗重復3次。

2.5 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組細胞的形態

對照組細胞形態飽滿、細胞密集且連接緊密、折光性好。與對照組比較，Aβ組細胞突觸變少、部分突觸斷裂消失、細胞變少且細胞間連接較松;與Aβ組比較，Aβ+SA組細胞變圓、突觸增多;與Aβ+SA組比較，Aβ+SA+LY組細胞形態較不規則、部分突觸損傷斷裂、細胞光圈變弱，Aβ+LY組細胞碎片較多;LY組細胞與對照組比較無明顯差異，詳見圖1。

3.2 各組細胞的存活情況

與對照組比較，Aβ 組細胞的存活率顯著降低（P<0.01）;與Aβ 組比較，Aβ+SA 組細胞的存活率顯著升高（P<0.05）;與Aβ+SA 組比較，Aβ+SA+LY組細胞的存活率顯著降低（P<0.05），而Aβ+LY 組細胞的存活率雖有下降，但組間比較差異無統計學意義（P>0.05）;同時，單獨給予 LY294002對PC12細胞的存活率無顯著影響（P>0.05），詳見表1。

3.3 各組PC12細胞PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β蛋白水平

與對照組比較，Aβ 組細胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β比值均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;與Aβ組比較，Aβ+SA 組細胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β比值均顯著升高（P<0.05）;與Aβ+SA組比較，Aβ+SA+LY 組細胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β比值均顯著降低（P<0.05），而Aβ+LY組細胞上述指標并無顯著變化（P>0.05）;同時，單獨使用LY294002對PC12細胞的存活率無顯著影響（P>0.05），詳見圖2、表2。

4 討論

AD的病因復雜，發病機制尚不清楚，目前的研究認為主要與以下幾個因素有關：Aβ聚集、Tau蛋白過度磷酸化、膽堿能神經細胞損傷、基因突變、炎癥因子增加、衰老、氧化應激以及鈣代謝紊亂等[15]。研究發現，AD患者的腦內有老年斑沉積，而Aβ是構成老年斑的主要成分，因此目前認為Aβ的異常沉積是AD主要的發病機制之一[16]。SA是一種天然的羥基肉桂酸，其相對分子量小，具有較高的親脂性，容易透過血腦屏障到達中樞神經系統[17]。有研究發現，SA能抑制氰化鉀（KCN）導致的小鼠缺氧和記憶障礙，對改善記憶功能有一定的效果[18];同時，SA及其衍生物芥子堿（Sinapine）也對氧化應激誘導的AD、共濟失調和帕金森病等神經退行性疾病有一定的治療作用[19]。另有研究發現，SA與阿魏酸、香豆酸、咖啡酸等相互作用，具有抗焦慮和改善記憶力的功效[20]。本研究結果驗證了Aβ1-42能夠誘導PC12細胞損傷，而SA能夠拮抗Aβ1-42誘導的這種損傷，說明SA具有神經細胞保護作用。本研究還發現，PI3K特異性抑制劑LY294002可逆轉SA拮抗Aβ1-42致PC12細胞損傷及神經保護作用，提示SA對神經細胞的保護作用可能與PI3K信號通路有關。

PI3K是細胞內信號轉導的重要激酶之一，由調節亞基p85和催化亞基p110 兩個結合位點構成。當受到細胞外刺激信號分子作用時，p85發生磷酸化，并解除了對p110的抑制，從而激活PI3K[21]。Akt是PI3K的下游直接靶點，在PI3K信號轉導通路中具有承上啟下的重要作用，Akt可在Ser473位點發生磷酸化，使Akt被激活，而許多保護機制的激活取決于Akt的磷酸化，如神經保護作用[22-23]?；罨腁kt能夠啟動PI3K/Akt信號通路下游級聯反應，進一步磷酸化下游的GSK3β[24]。在最新研究中發現，GSK3β的神經毒性可直接導致神經細胞的凋亡，誘導AD的發生;然而GSK3β磷酸化水平的增高則可抑制GSK3β的活性，減輕神經細胞的損傷[25]。另有研究表明，SA可通過PI3K/Akt/GSK3β下游的p38絲裂原活化蛋白激酶/環磷腺苷效應元件結合蛋白（MAPK/CREB）信號通路，啟動3T3-L1脂肪細胞褐變，提示SA可參與PI3K/Akt/GSK3β信號通路的調控[26]。本研究結果顯示，Aβ1-42可顯著降低PC12細胞中PI3K、Akt、GSK3β的磷酸化水平，SA能夠回調Aβ1-42誘導的上述蛋白的磷酸化;而LY294002可逆轉SA對PI3K、Akt、GSK3β磷酸化水平的回調作用。這說明SA對Aβ1-42致細胞損傷的保護作用可能是通過活化PI3K，使其下游靶點蛋白Akt磷酸化，從而使下游底物GSK3β發生磷酸化，進而激活PI3K/Akt/GSK3β信號通路來實現的。

綜上所述，本研究發現SA對Aβ1-42誘導的PC12細胞損傷具有保護作用，其機制可能與其激活PI3K/Akt/GSK3β信號通路有關。由于AD的發病機制復雜，涉及多種信號轉導通路，本研究只檢測了PI3K、Akt、GSK3β，未檢測PI3K/Akt信號通路的其他蛋白，如B淋巴細胞瘤-2基因相關啟動子（Bad）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）等[26]，因此還有待于進一步研究加以證實。

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（收稿日期：2020-04-04 修回日期：2020-08-04）

（編輯：羅 瑞）