當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷大鼠心肌細(xì)胞H9C2自噬的調(diào)控作用研究

浦延鵬 周佳明

摘 要 目的：探討當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)缺氧/復(fù)氧（H/R）損傷大鼠心肌細(xì)胞H9C2自噬的調(diào)控作用。方法：以大鼠心肌細(xì)胞H9C2為對(duì)象，在CCK-8法篩選當(dāng)歸揮發(fā)油最佳給藥濃度和給藥時(shí)間的基礎(chǔ)上，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)當(dāng)歸揮發(fā)油作用后細(xì)胞上清液中乳酸脫氫酶（LDH）的活性;以自噬抑制劑（3-甲基腺嘌呤，5 mmol/L）為陽(yáng)性對(duì)照，采用MDC法和Western blotting法分別檢測(cè)藥物作用后細(xì)胞中MDC的平均熒光強(qiáng)度以及自噬相關(guān)蛋白[Beclin-1、微管相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅱ（LC3Ⅱ）、LC3Ⅰ]的表達(dá)情況。結(jié)果：經(jīng)0.6 μmol/L當(dāng)歸揮發(fā)油作用6 h后，與空白組比較，H/R組細(xì)胞上清液中LDH活性和細(xì)胞中MDC平均熒光強(qiáng)度、Beclin-1表達(dá)水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均顯著升高，細(xì)胞中p62表達(dá)水平顯著降低（P<0.05或P<0.01）;與H/R組比較，H/R+藥物組細(xì)胞上清液中LDH活性，H/R+藥物組和H/R+自噬抑制劑組細(xì)胞中MDC平均熒光強(qiáng)度、Beclin-1表達(dá)水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均顯著降低，細(xì)胞中p62表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：當(dāng)歸揮發(fā)油可通過(guò)調(diào)控自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)降低H/R損傷心肌細(xì)胞的自噬水平。

關(guān)鍵詞 當(dāng)歸揮發(fā)油;缺氧/復(fù)氧;大鼠心肌細(xì)胞H9C2;自噬

中圖分類(lèi)號(hào) R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2020）20-2492-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.20.11

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the regulation effects of volatile oil from Angelica sinensis on autophagy of myocardial cell H9C2 in rats with hypoxia and reoxygenation （H/R） injury.? METHODS： Using myocardial cell H9C2 as subject， CCK-8 method was used to screen the optimal concentration and administration time of volatile oil from A. sinensis. The acitivity of LDH in cell supernatant was determined after treated with volatile oil from A. sinensis by ELISA. Using autophagy inhibitors （3-methyladenine， 5 mmol/L） as positive control， MDC method and Western blotting assay were used to detect average fluorescence intensity of MDC and the expression of autophagy related proteins [Beclin-1， microtubule associated protein light chain 3Ⅱ（LC3Ⅱ）， LC3Ⅰ] in H9C2 cells after treated with medicines. RESULTS： After treated with 0.6 μmol/L violate oil from A. sinensis for 6 h， compared with blank group， LDH activity in cell supernatant， average fluorescence intensity of MDC， the expression of Beclin-1， LC3Ⅱ/LC3Ⅰ ratio in cells were increased significantly in H/R group， while the expression of p62 was decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with H/R group， the activity of LDH in cell supernatant of H/R+drug group as well as average fluorescence intensity of MDC， the expression of Beclin-1， LC3Ⅱ/LC3Ⅰratio in cells in H/R+drug group and H/R+autophagy inhibitor group were decreased significantly， while the expression of p62 were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： The volatile oil from A. sinensis can reduce the autophagy level of H/R injury myocardial cells by regulating the expression of autophagy related proteins.

KEYWORDS? ?Volatile oil from Angelica sinensis; Hypoxia/reoxygenation; Myocardial cell H9C2 of rats; Autophagy

缺血性心臟病大多是由冠狀動(dòng)脈供血不足所致，可引起心肌損傷。如果能及時(shí)恢復(fù)心臟供血，可恢復(fù)心臟功能;但也可能導(dǎo)致心肌損傷加重，造成缺血/再灌注（I/R）損傷[1-2]。在很多情況下，機(jī)體會(huì)出現(xiàn)I/R損傷，如創(chuàng)傷、收縮后血管回流、經(jīng)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)、溶栓治療等，而當(dāng)受損的缺血心肌組織經(jīng)過(guò)干預(yù)再次恢復(fù)血液灌注時(shí)，往往會(huì)伴隨著組織損傷加重的可能，引起心功能不全、再灌注心律失常和心肌梗死加重等[3-4]。因此，如何有效改善I/R所致組織損傷成為了學(xué)者研究的熱點(diǎn)。

導(dǎo)致心肌I/R損傷的機(jī)制較復(fù)雜，而自噬在組織損傷中扮演了重要的角色。有研究表明，自噬可降解老化的蛋白質(zhì)及受損的細(xì)胞器，在維持心臟的正常形態(tài)和功能以及改善心肌I/R損傷等方面發(fā)揮了積極作用[5]。但是，自噬對(duì)細(xì)胞的作用是雙向的，過(guò)度自噬也可以造成組織損傷[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，中藥能有效縮小I/R后組織的壞死面積，并能改善相應(yīng)臟器的功能障礙，其治療機(jī)制可能與對(duì)自噬作用的調(diào)控有關(guān)[7]。

中藥當(dāng)歸以補(bǔ)血通絡(luò)為主要功效，常用于胸痹等缺血性疾病的治療，而揮發(fā)油是當(dāng)歸的主要活性成分之一。已有文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)歸揮發(fā)油可對(duì)大鼠局灶性腦I/R損傷發(fā)揮保護(hù)作用[8]，并且對(duì)平滑肌[9]、免疫系統(tǒng)[10-12]及心血管系統(tǒng)[13-14]等也有相應(yīng)的保護(hù)作用。但是，當(dāng)歸揮發(fā)油的作用機(jī)制是否與自噬有關(guān)，目前尚未得到證實(shí)。因此，筆者以當(dāng)歸揮發(fā)油預(yù)處理大鼠心肌H9C2細(xì)胞，以缺氧/復(fù)氧（H/R）模擬心肌I/R損傷，并選用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）作為陽(yáng)性對(duì)照，探討當(dāng)歸揮發(fā)油是否能通過(guò)調(diào)節(jié)自噬對(duì)大鼠心肌H9C2細(xì)胞的H/R損傷來(lái)發(fā)揮保護(hù)作用，以期為當(dāng)歸揮發(fā)油在心肌I/R損傷研究領(lǐng)域中的開(kāi)發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

MCO-15AC型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）;BX53T-32F01-FLB3型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）;Infinite 200 PRO型多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）;1708625型電泳儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）;HS-1800型超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

當(dāng)歸揮發(fā)油[甘肅康達(dá)藥業(yè)開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20190916，含量：81.4%（以藁苯內(nèi)酯計(jì)）];自噬抑制劑3-MA對(duì)照品（美國(guó)Targetmol公司，批號(hào)：T1897，純度：98%）;胎牛血清（美國(guó)Clark公司，批號(hào)：FB25015）;DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基（批號(hào)：90113）、青鏈霉素混合液（批號(hào)：P1400）、二甲亞砜（DMSO，批號(hào)：D8371）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;0.25%蛋白胰酶（批號(hào)：SH30031.02）、DMEM/F12培養(yǎng)基（批號(hào)：SH30213.02）均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;增強(qiáng)型CCK-8試劑盒（上海尚寶生物科技有限公司，批號(hào)：ST1006）;細(xì)胞自噬染色（MDC法）檢測(cè)試劑盒（北京雷根生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：DA0041）;乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：WLA073）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）快速制備試劑盒（批號(hào)：WLA013）、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒（批號(hào)：WLA004）、超敏ECL試劑盒（批號(hào)：WLA006）、兔源β-actin多克隆抗體（批號(hào)：WL0002c）、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）二抗（批號(hào)：WLA023a）、兔源Beclin-1多克隆抗體（批號(hào)：WL02508）、兔源p62多克隆抗體（批號(hào)：WL02385）、RIPA裂解液（批號(hào)：WLA014）均購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司;兔源微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）Ⅱ/LC3Ⅰ多克隆抗體（美國(guó)Proteintech公司，批號(hào)：14600-1-AP）;厭氧產(chǎn)氣包和厭氧培養(yǎng)袋均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為蒸餾水（三級(jí)）。

1.3 細(xì)胞

大鼠心肌H9C2細(xì)胞購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

2 方法

2.1 藥物工作液制備

取當(dāng)歸揮發(fā)油1 g，加適量DMSO溶解后，以DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基配制成質(zhì)量濃度為4.28 mmol/L的母液，于-20 ℃下保存;臨用前，用DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)質(zhì)量濃度的工作液。稱(chēng)取3-MA適量，以DMEM/F12培養(yǎng)基制成濃度為5 mmol/L的工作液，備用。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將H9C2細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清及1%青鏈霉素混合液的DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基中，置于 37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

2.3 H/R損傷細(xì)胞模型的建立

參考文獻(xiàn)方法[15]選取缺氧2 h、復(fù)氧4 h為模型建立條件：取H9C2細(xì)胞，復(fù)蘇，待其生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿的80%～90%時(shí)，棄去培養(yǎng)基，以無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）洗滌后，加入不含血清的DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基，置于厭氧培養(yǎng)袋中（內(nèi)有一個(gè)打開(kāi)的厭氧產(chǎn)氣包）進(jìn)行密封培養(yǎng)2 h，使細(xì)胞缺氧;隨后，以不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基替換DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h進(jìn)行復(fù)氧，以建立H/R損傷細(xì)胞模型。

2.4 當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)H9C2細(xì)胞活力的影響

采用CCK-8法檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2細(xì)胞，用無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，并以1×104個(gè)/孔接種于96孔板中，每孔100 μL。將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組和不同濃度當(dāng)歸揮發(fā)油組，在37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。以無(wú)菌PBS洗滌后，除空白對(duì)照組不加藥外，其余各組均加入無(wú)菌當(dāng)歸揮發(fā)油工作液（終濃度分別為0、20、40、60、80、100 μmol/L），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)2、4、6 h后，棄上清液，每孔加入無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基100 μL和CCK-8檢測(cè)試劑10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)40 min，采用多功能酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度（OD）值并按說(shuō)明書(shū)公式計(jì)算各組的相對(duì)細(xì)胞活力，OD值越高，細(xì)胞活力越強(qiáng)[4]。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)H9C2細(xì)胞上清液中LDH活性的影響

采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2細(xì)胞，按“2.4”項(xiàng)下方法制備細(xì)胞懸液后，以1×104個(gè)/孔接種于96孔板中，每孔100 μL。將細(xì)胞隨機(jī)分為空白組、模型組（H/R組）、H/R+藥物組（給藥濃度參考“2.4”項(xiàng)下結(jié)果，下同），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。空白組不作任何處理;H/R組、H/R+藥物組先參照“2.3”項(xiàng)下方法建立H/R損傷模型，藥物組再給予相應(yīng)藥物。培養(yǎng)適宜時(shí)間（時(shí)間參考“2.4”項(xiàng)下結(jié)果，下同）后，收集各組細(xì)胞上清液。參照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用多功能酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)并計(jì)算LDH活性。LDH活性越高，則細(xì)胞自噬水平越高[5]。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)H9C2細(xì)胞自噬水平的影響

采用MDC法檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2細(xì)胞，按“2.4”項(xiàng)下方法制備細(xì)胞懸液后，以5×103個(gè)/孔接種于96孔板中，每孔100 μL。將細(xì)胞隨機(jī)分為空白組、模型組（H/R組）、H/R+藥物組（終濃度同“2.5”項(xiàng)）、H/R+自噬抑制劑組（3-MA終濃度為5 mmol/L[16]）。空白組不作任何處理;H/R組、H/R+藥物組、H/R+自噬抑制劑組先參照“2.3”項(xiàng)下方法建立H/R損傷模型，各藥物組再給予相應(yīng)藥物。培養(yǎng)適宜時(shí)間后，以無(wú)菌PBS輕柔清洗2次，洗去藥物和抑制劑后，每孔加入MDC染色工作液100 μL，于37 ℃、5%CO2條件下避光孵育 15～60 min;然后，各孔加入PBS 100 μL清洗2～3次后，置于熒光顯微鏡下，觀察MDC染色情況，隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行拍照，使用Iamge-Pro Plus 6.0圖像處理軟件分析染色部位的積分光密度（IOD）并計(jì)算MDC平均熒光強(qiáng)度。平均熒光強(qiáng)度值越高，則細(xì)胞自噬水平越高[6]。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)H9C2細(xì)胞中Beclin-1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、p62蛋白表達(dá)的影響

采用Western blotting法檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2細(xì)胞，參照“2.6”項(xiàng)下方法接種、分組、造模、給藥，培養(yǎng)適宜時(shí)間后，棄去培養(yǎng)液，用PBS輕柔清洗1～2次后，加入RIPA裂解液200 μL和苯甲基磺酰氟（PMSF）2 μL，并進(jìn)行冰上裂解。細(xì)胞充分裂解后，于4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，取上層總蛋白提取液，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取蛋白適量，在100 ℃下行變性處理后，進(jìn)行15% SDS-PAGE，隨后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，以7%脫脂奶粉于室溫下封閉1 h;用TBST溶液清洗10 min×3次，然后加入自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、p62抗體和內(nèi)參β-actin抗體（稀釋度均為1 ∶ 500），4 ℃孵育過(guò)夜;以TBST溶液清洗10 min×3次，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 500），室溫孵育2 h;以TBST溶液清洗10 min×3次，滴加ECL顯影液，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光成像，采用Image J 1.8.0圖像處理軟件測(cè)量各目標(biāo)蛋白灰度值，并以?xún)?nèi)參蛋白灰度值為參照計(jì)算相對(duì)灰度值以表示目標(biāo)蛋白（Beclin-1、p62）的表達(dá)水平，同時(shí)計(jì)算LC3Ⅱ、LC3Ⅰ的灰度值比值（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值”）。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)H9C2細(xì)胞活力的影響

與空白組比較，不同濃度當(dāng)歸揮發(fā)油組細(xì)胞在培養(yǎng)2、4、6 h后的相對(duì)活力均無(wú)顯著變化（P>0.05），且在一定程度上有隨濃度增加而升高的趨勢(shì)，并在當(dāng)歸揮發(fā)油60 μmol/L時(shí)達(dá)到最高值;且隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，這一作用越發(fā)明顯，其中以60 μmol/L當(dāng)歸揮發(fā)油培養(yǎng)6 h時(shí)的細(xì)胞相對(duì)活力最高，故本研究選取上述條件進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。不同濃度當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)H9C2細(xì)胞相對(duì)活力的影響見(jiàn)圖1。

3.2 當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)H9C2細(xì)胞上清液中LDH活性的影響

與空白組比較，H/R組細(xì)胞上清液中LDH活性顯著升高（P<0.05）;與H/R組比較，H/R+藥物組細(xì)胞上清液中LDH活性顯著降低（P<0.05）。當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)H9C2細(xì)胞上清液中LDH活性的影響見(jiàn)圖2。

3.3 當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)H9C2細(xì)胞自噬水平的影響

與空白組比較，H/R組細(xì)胞的MDC平均熒光強(qiáng)度顯著升高（P<0.01）;與H/R組比較，H/R+藥物組和H/R+自噬抑制劑組細(xì)胞的MDC平均熒光強(qiáng)度均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)H9C2細(xì)胞自噬水平影響的熒光顯微圖和自噬水平檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4。

3.4 當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)H9C2細(xì)胞中Beclin-1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、p62蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，H/R組細(xì)胞中Beclin-1表達(dá)水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均顯著升高，p62表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）;與H/R組比較，H/R+藥物組和H/R+自噬抑制劑組的Beclin-1表達(dá)水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均顯著降低，p62表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）。當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)H9C2細(xì)胞中Beclin-1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、p62蛋白表達(dá)影響電泳圖和表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5、圖6。

4 討論

隨著時(shí)代的發(fā)展和生活水平的不斷提高，人們的不良飲食習(xí)慣日漸增多;與此同時(shí)，高血脂、高血壓、糖尿病等代謝性疾病的發(fā)病率呈增高的趨勢(shì)，由此類(lèi)基礎(chǔ)疾病導(dǎo)致的缺血性心臟病的發(fā)病率也逐年升高，嚴(yán)重威脅人們的健康。缺氧和局部缺血后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞能量供應(yīng)不足，進(jìn)而造成心肌損傷，此時(shí)應(yīng)盡快恢復(fù)正常的血供以使心臟損傷降至最低;然而在恢復(fù)血供的同時(shí)，再灌注損傷亦隨之出現(xiàn)，并有可能進(jìn)一步加重病情[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，I/R所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡與自噬密切相關(guān)，當(dāng)發(fā)生I/R損傷后，機(jī)體可通過(guò)自噬作用來(lái)清除受損的細(xì)胞器來(lái)減少細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮保護(hù)作用[17]。自噬是細(xì)胞的一種自我降解和清除的動(dòng)態(tài)過(guò)程，當(dāng)機(jī)體受到外界刺激而導(dǎo)致細(xì)胞器受損時(shí)，就會(huì)激活自噬作用以清除受損細(xì)胞器和蛋白質(zhì)[18-19]。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，有的中藥成分可通過(guò)抑制神經(jīng)元的過(guò)度自噬來(lái)協(xié)助I/R后相應(yīng)臟器的功能恢復(fù)[7]。可見(jiàn)，自噬作為I/R損傷中重要的病理變化，已經(jīng)成為學(xué)者們研究的熱點(diǎn)[20]。

有研究表明，細(xì)胞上清液中LDH的活性可以反映細(xì)胞自噬水平，且LDH活性升高，細(xì)胞自噬作用增強(qiáng);同時(shí)，選用MDC法可以直觀地評(píng)估藥物作用后的細(xì)胞自噬水平，即MDC平均熒光強(qiáng)度升高，細(xì)胞自噬水平增強(qiáng)[21]。在自噬過(guò)程中，LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ是生成自噬體膜的必備物質(zhì)，是自噬體形成的最重要分子，因此常被作為自噬的標(biāo)志蛋白，且LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高時(shí)，細(xì)胞的自噬水平亦升高[22];而自噬底物蛋白p62可通過(guò)在C端與泛素化蛋白結(jié)合，以及在N端與LC3Ⅱ結(jié)合，從而參與自噬的降解[23]。因此，通過(guò)檢測(cè)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和p62蛋白的表達(dá)水平，可以評(píng)估細(xì)胞自噬水平的高低。此外，在自噬體形成的初始階段，Beclin-1可與Ⅲ型胞內(nèi)磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、p150蛋白結(jié)合形成Ⅲ型PI3K復(fù)合體，并作為該復(fù)合體的中心蛋白，主要發(fā)揮促使自噬體成熟的作用[24];同時(shí)，Beclin-1還能與Atg1、Atg9作用，共同參與調(diào)控吞噬泡的形成，最終促進(jìn)自噬的發(fā)生[25]。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1、p62蛋白的表達(dá)水平來(lái)評(píng)價(jià)藥物對(duì)細(xì)胞自噬水平的影響。3-MA是一種特異性針對(duì)自噬作用的常用抑制劑，廣泛應(yīng)用于自噬誘導(dǎo)的研究中[26]，因此筆者選用3-MA作為陽(yáng)性對(duì)照，以對(duì)比研究當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)H/R損傷H9C2細(xì)胞自噬的影響。結(jié)果顯示，與空白組比較，H/R組細(xì)胞上清液中LDH活性顯著升高，細(xì)胞中MDC平均熒光強(qiáng)度顯著升高，Beclin-1表達(dá)水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高，p62表達(dá)水平降低（P<0.05）。這表明發(fā)生H/R后，細(xì)胞的自噬作用增強(qiáng)。與H/R組比較，H/R+藥物組細(xì)胞上清液中LDH活性均顯著降低，且H/R+藥物組和H/R+自噬抑制劑組細(xì)胞中MDC平均熒光強(qiáng)度均顯著降低，Beclin-1表達(dá)水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著減少，p62表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）。這表明經(jīng)當(dāng)歸揮發(fā)油及自噬抑制劑干預(yù)后，細(xì)胞的自噬作用受到了抑制。

綜上所述，當(dāng)歸揮發(fā)油能顯著降低H/R損傷心肌細(xì)胞H9C2的自噬水平，這一作用與其可降低自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ蛋白的表達(dá)，增加p62蛋白的表達(dá)有關(guān)。

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（收稿日期：2020-06-14 修回日期：2020-09-21）

（編輯：羅 瑞）