一種枯草芽孢桿菌的計數方法

王梅 盧宗梅 陳影 周勇 邴狄祥 劉利利 郭世堂 徐曉然

摘? ? ? 要：為了對一株高度黏連的產多種酶的枯草芽孢桿菌進行有效的活菌計數，試驗采用普通培養基，蛋白胨添加質量分數1%、0.5%，牛肉粉和牛肉膏添加質量分數0.3%，氯化鈉添加質量分數1%、0.5%，瓊脂粉添加量1.5%、3.0%，在不同添加量下進行活菌計數及芽孢計數研究分析。試驗結果表明：普通培養基平板蛋白胨、牛肉粉和牛肉膏、氯化鈉不同添加量條件下，該菌株枯草芽孢桿菌在平板顯示菌落個數仍然比較大，菌落黏連在一起，造成計數偏低，難以形成有效的活菌計數，對產品質量無法準確判斷。針對這種情況，最終優化出一種合適平板培養基，蛋白胨1%、牛肉膏0.3%、氯化鈉0.5%、瓊脂粉3.0%（均為質量分數），使本菌能夠生長并菌落獨立，計數結果準確，重復性好。說明在活菌計數和芽孢計數中，優化培養基是某些特殊菌株（菌落黏連）的理想計數方法。

關? 鍵? 詞：枯草芽孢桿菌;培養基;計數

中圖分類號： TQ016.1? ? ? 文獻標識碼： A? ? ? 文章編號： 1671-0460（2020）09-1930-04

Abstract： In order to count a highly adherent bacillus subtilis which can produce multiple enzymes， in the experiment， the viable bacteria count and spore count were studied by adding 1%，0.5% peptone， 0.3% beef powder and beef extract， 1% or 0.5% sodium chloride， 1.5% or 3.0% agar powder. The results showed that the number of colonies of Bacillus subtilis was still relatively large on the plate with the common medium containing peptone， beef powder， beef extract and sodium chloride， and the colonies adhered together， resulting in a low count， it was difficult to form an effective count of viable bacteria， and the quality of products could not be accurately judged. In view of this situation， a suitable plate culture medium was finally optimized， containing peptone 1% ， beef extract 0.3% ， sodium chloride 0.5% and agar powder 3.0% . It was shown that the optimum medium was an ideal method for counting some special strains （colony adhesion） in the enumeration of living bacteria and spores.

Key words： Bacillus subtilis; Medium; Counting

枯草芽孢桿菌是我國允許使用的飼料微生物菌種，因其無毒、無害，經常被制成微生物添加劑，枯草芽孢桿菌在制劑中以內生孢子形式存在。微生物飼料添加劑年產量已經超過二十幾萬噸，目前我國從事生物飼料行業的企業數量已經超過一千多家，發酵飼料年產品產量一百多萬噸[1-2]。枯草芽孢桿菌已經作為微生物菌劑對外銷售，國家對于微生物菌劑以及發酵飼料方面質量標準及控制，將不斷的規范化。

枯草芽孢桿菌是一類好氧細菌，芽孢桿菌能產淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等，還可以抑制動物腸道中有害菌的生長，維持動物腸道的生態平衡 [3]。

微生態制劑及培養細菌的計數，一般經常使用的方法有平板稀釋法、吸光值法、顯微鏡檢測法? ?等[4-5]，在活菌計數和芽孢計數中， 目前最穩定且可靠是平板稀釋計數法。

在現階段的工業化生產中，本菌株枯草芽孢桿菌生長繁殖迅速，普通培養基平板計數，菌落黏連在一起，單獨菌落個數比較大，活菌數和芽孢數計數偏低，對產品質量無法準確判斷，針對這種情況，進行培養基優化，調整氮源、碳源、有機鹽、瓊脂粉添加量，最終優化培養基使本菌能夠生長并且菌落獨立、準確計數。

1? 實驗部分

1.1? 菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus sublilis）由中糧生物科技股份有限公司研發基地分離、鑒定并保存菌種，菌種編號ZLK1。

1.2? 培養基

普通培養基： 蛋白胨10 g， 牛肉粉3.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 000 mL， pH 7.0+0.2，121 ℃滅菌20 min。

優化培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏3.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂粉30 g，蒸餾水1 000 mL， pH 7.0+0.2，121 ℃滅菌20 min。

1.3? 試驗方法[6]

平板菌落計數法是根據微生物在固體培養基上所形成的一個菌落是由一個單細胞繁殖而成的現象進行的，也就是說一個菌落即代表一個單細胞。

首先將培養皿裝進不銹鋼桶里，然后放入烘箱180 ℃干熱滅菌2～3 h，放無菌室凈化臺冷卻待用。

分別將配好的普通培養基和優化培養基121 ℃滅菌20 min，冷卻至50～40 ℃左右，在無菌室凈化臺上，將其倒入已干熱滅菌的培養皿中，約? ?20 mL/90 mm培養皿，等冷卻凝固后，把倒置培養皿放入35 ℃培養箱中空培養24～48 h，最后把培養皿裝進不銹鋼桶里，放置4 ℃冰箱保存備用。

準確的稱取樣品5.00 g（或5.00 mL），置入? ? 45 mL無菌水的帶擋板的三角瓶中，震蕩器震動? 30 min，即為1∶10的稀釋液。

從1∶10的稀釋液中吸取0.1 mL置入0.9 mL無菌水的玻璃試管中，用振蕩器混勻。

依次按照10倍的稀釋液稀釋，每次稀釋前，一定要換無菌的吸頭，選擇合適的稀釋梯度，吸取? 0.1 mL稀釋液放入空培養的平板中，用涂布棒將稀釋好的菌液涂布均勻，每個稀釋梯度涂幾塊平行平板，倒置于30 ℃恒溫培養箱中，培養24 h后取出計數。

選取菌落數在30～300個之間的平皿計數，不黏連、單獨菌落生長的平皿計算菌落總數。大于300個菌落的平皿記錄為不可計。低于30個菌落的平皿記錄具體菌落數，每個稀釋梯度的菌落數取3塊平皿的平均數，若只有一個稀釋梯度平皿上的菌落數在適宜計數范圍內，計算2塊平皿菌落數的平均值， 取平均值乘以相應稀釋倍數，即得每克或每毫升樣品所含枯草芽孢桿菌發酵液活菌的總數。

1.4? 主要設備

培養箱，MIR-162三洋恒溫培養箱，旋渦震蕩器，分析天平，YXQ高壓滅菌鍋，水浴鍋，90 mm培養皿，蜀牛牌三角燒瓶（規格1 000 mL和250 mL），移液器，移液槍頭，1 mL和5 mL吸管，離心管，18×180試管，涂布棒，不銹鋼培養皿桶，電磁爐，不銹鋼鍋。

2? 結果與討論

2.1? 蛋白胨

蛋白胨是一種外觀呈淡黃色的粉劑，蛋白胨當中不僅含有豐富的氨基酸、細菌需要生長的維生素和其他生長因子，還含有許多硫氨基酸等。蛋白胨在培養基當中起的主要作用是提供氮源。

有機氮源不但含有某些生長因子以及少量脂肪、糖類、維生素，而且含有豐富的蛋白質、多肽、氨基酸等。因此在含有有機氮源的培養基中微生物不但生長特別旺盛，而且菌體數量增長快速，代謝產物積累豐富 [7-8]。

由表1可知優化后培養基調整氮源從1.0%降到0.5%，用枯草芽孢桿菌發酵終點種子液稀釋涂布，結合圖1分析可知，調整氮源添加量對菌落生長、蔓延沒有影響，菌落個數依然比較大，菌落易黏連在一起。

2.2? 牛肉粉和牛肉膏

牛肉粉則以牛肉為原料，經熱處理，過濾，濃縮，干燥制成牛肉原粉，再將牛肉原粉經過水解，固液分離，冷藏，過濾，濃縮及干燥等工序即可獲得牛肉粉，其能為微生物提供碳源、能源、磷酸鹽和維生素。牛肉粉和牛肉膏的作用同為微生物提供碳源、磷酸鹽、維生素。牛肉粉添加量0.3%，牛肉膏添加量0.5%、0.3%。結果如圖2所示。

普通培養基牛肉粉添加量0.3%牛肉粉和優化培養基牛肉膏添加量分別為0.3%、0.5%。同樣用枯草芽孢桿菌發酵終點種子液稀釋涂布，由平板結果顯示，牛肉膏添加0.3%和0.5%在平板培養基中無明顯區別。用牛肉粉替代牛肉膏是可行的。由圖2菌株形態可知，菌落個數依然大，菌落易蔓延，無法準確計數。牛肉粉和牛肉膏添加培養基中對菌落生長影響不明顯。

2.3? 氯化鈉

氯化鈉是微生物發酵培養基的必要成分，鈉離子能夠維持細胞滲透壓，因此需要在培養基中加入少量的鈉鹽，但添加量不能過高，否則影響微生物的生長[8-9]。枯草芽孢桿菌在5%的NaCl溶液中能正常生長，而在10%的NaCl溶液中生長受到抑制。

優化普通培養基中的氯化鈉添加量，由0.5%調整到1%，同樣用枯草芽孢桿菌發酵終點種子液稀釋涂布，結果如圖3所示，菌落個數依然大，菌落生長易蔓延、易黏連一起，無法準確計數。1%氯化鈉添加量未影響枯草芽孢桿菌生長。說明氯化鈉添加量0.5%和1%對枯草芽孢桿菌生長及菌落變化沒有顯著影響，只有在10%的NaCl溶液中枯草芽孢桿菌生長受到抑制。

2.4? 瓊脂粉

瓊脂粉不溶于冷水，緩溶于熱水中，更容易在沸水中溶解 [10]。瓊脂起凝固劑作用，在普通培養基的基礎上優化培養基中的瓊脂粉由1.5%調整到3.0%，配制成平板培養基，同樣用枯草芽孢桿菌發酵終點種子液稀釋涂布，結果如圖5所示，菌落呈圓形，邊緣整齊，不蔓延，菌落獨立生長，比普通培養基中瓊脂粉多加一倍。

2.5? 普通培養基和優化培養基配方對比

由表2可知，普通培養基里用的是牛肉粉，而優化培養基用的是牛肉膏，普通培養基的瓊脂粉添加量是1.5%，而優化培養基的瓊脂粉添加量是3.0%，瓊脂粉多加一倍的量。

2.6? 兩種平板多次計數對比結果

研究對枯草芽孢桿菌進行普通培養基平板和優化培養基平板多次計數，表3是取3次枯草芽孢桿菌發酵液活菌計數的結果。由表3可知，普通培養基平板計數的結果比較低，而從優化培養基平板計數的結果來看，梯度性、平行性非常好，菌落易計數。另外，從涂平板后菌落的獨立生長易計數。說明瓊脂粉添加量由1.5%調整到3.0%，根據平板結果可知，優化培養基平板菌落分布均勻、獨立，該方法也非常穩定、可靠。

2.7? 枯草芽孢桿菌芽孢菌落計數[6]

首先以無菌操作稱取枯草芽孢桿菌發酵液5 mL，加入45 mL 0.85%滅菌生理鹽水中，用振蕩器混勻1～2 min， 制成1∶10的初始懸浮液。吸取1∶10的初始懸浮液1 mL，加入9 mL 0.85%滅菌生理鹽水中，經振蕩器混勻后制成1∶100的稀釋液。根據樣品含菌量，做進一步的十倍系列遞增稀釋。

選擇2～3個適宜的稀釋度，水浴（80±1） ℃維持10 min，用無菌移液槍頭吸取0.1 mL，接種到培養皿中，使用涂布棒均勻分布于平皿中的培養基內，涂布好的平皿蓋好，置室溫放置15 min使接種物完全被瓊脂吸收。放置30 ℃恒溫培養箱培養24 h后，如圖4所示，在普通培養基平板上有10-6? 53個菌落，菌落呈水滴狀，好多菌落黏連在一起，菌落比較大，易覆蓋其他菌落，無法準確計數。

優化培養基如圖5所示，菌落呈圓形，邊緣整齊， 在同一個梯度上，10-6 152個菌落，優化培養基的菌落比普通培養基培養菌落生長的個數多，易準確計數。

結果表明，該菌株在普通培養基平板上生長，菌落呈水滴狀且具有較高黏連性，不適合在普通培養基培養計數。而在優化培養基中瓊脂粉添加質量分數由1.5%提高3.0%，使培養基硬度適宜，不影響本菌株生長，菌落邊緣不蔓延，不黏連在一起，菌落邊緣整齊，菌落分布均勻，能夠準確計數。

通過對培養枯草芽孢桿菌平板培養基各項指標分析及對比驗證，該菌株枯草芽孢桿菌適宜在優化培養基中培養，不會抑制菌落生長，菌落邊緣整齊，不蔓延，不黏連在一起，易準確菌落計數。因此，在活菌計數和芽孢計數中，優化培養基是適合本菌株枯草芽孢桿菌的最佳計數方法。

參考文獻：

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