pH響應型六臂星形共聚物的制備及藥物控釋研究

姚琳 余麗麗 馬薇 寇佳輝 申婷婷

摘? ? ? 要：通過開環聚合（ROP）和原子轉移自由基聚合（ATRP）設計合成了兩種兩親性六臂星形共聚物聚己內酯-b-聚甲基丙烯酸羥基乙酯（6sPCL-b-PHMEA）和聚己內酯-b-聚甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯-b-聚甲基丙烯酸羥基乙酯（6sPCL-b-PDEAM-b-PHEMA）。采用傅立葉變換紅外光譜（FT-IR）和動態光散射技術（DLS）研究了共聚物的結構和膠束的粒徑，并以阿霉素（DOX）為模型藥物考察了兩種膠束的藥物控釋動力學。結果表明：兩種膠束均具有合適的粒徑，可作為DOX載體，6sPCL-b-PHEMA和6sPCL-b-PDEAM-b-PHEMA膠束的載藥量分別為11.56%和14.23%。體外釋藥實驗結果表明，與二嵌段星形共聚物相比，三嵌段星形共聚物具有顯著的pH敏感性，pH值從7.4降至2.2時，膠束中DOX的累積釋藥率顯著增大。這種pH響應的六臂星形共聚物具有潛在的抗癌藥物控釋應用前景。

關? 鍵? 詞：星形共聚物;原子轉移自由基聚合;酸敏感;藥物控釋

中圖分類號：TQ 314? ? ? ? 文獻標識碼： A? ? ? ?文章編號： 1671-0460（2020）09-1884-05

Abstract： Two amphiphilic six-arm star copolymers poly（ε-caprolactone）-b-poly（hydroxyethyl methacrylate） （6sPCL-b-PHMEA） and poly（ε-caprolactone）-b-poly（diethylaminoethyl methacrylate）-b-poly（hydroxyethyl methacrylate （6sPCL-b-PDEAM-b-PHEMA） with pH-responsive were designed and synthesized by ring-opening polymerization （ROP） and atom transfer radical polymerization （ATRP） process. The structure of the copolymers and the particle size of macromolecular micelles were investigated by Fourier transform infrared spectroscopy （FT-IR） and dynamic light scattering （DLS）， and the drug delivery capacities of the two micelles were detected using adriamycin （DOX） as the model drug. The results showed that， the both micelles had appropriate particle size and could be used for DOX carrier， the DLC of 6sPCL-b-PHEMA and 6sPCL-b-PDEAM-b-PHEMA micelles were 11.56% and 14.23%， respectively. The release process showed that， comparing to the diblock star copolymer， triblock star copolymer had more significant pH-sensitivity. The release of DOX from micelles was enhanced with the pH decreased from 7.4 to 2.2. The pH-sensitive six-arm star copolymer might possess potential application for anticancer drug delivery.

Key words： Star copolymer; Atom transfer radical polymerization; pH Sensitive; Controlled drug delivery

兩親性聚合物含有疏水性和親水性結構，可通過自組裝形成具有“核-殼”結構的聚合物膠束，因具有低毒性、血液循環長、可溶解疏水性藥物和高度內化等優點，廣泛用于藥物載體的研究[1-2]。由于膠束的納米尺寸效應，聚合物膠束可通過被動或主動靶向作用富集在腫瘤部位（EPR效應），實現抗腫瘤藥物的特異性釋放，有效地抑制腫瘤生長[3]。為了提高化療藥的療效、控制毒副作用等可通過腫瘤組織和正常組織的差異，如pH[4-5]、還原型谷胱甘肽（GSH）[6]、溫度[7]等，設計一系列的刺激響應型智能聚合物膠束，這類膠束可在正常生理條件下穩定存在，而在腫瘤部位環境下達到藥物的快速釋放[8]。

在對載體材料的研究中，星形聚合物作為一類高度支化聚合物，以多功能支化點為“核”，以核發射出的若干線性鏈作為“臂”，這種獨特的結構使其具有與線性聚合物完全不同的理化性質[9]。星形聚合物具有獨特的結構，其鏈相對較短，但相對分子質量較高，形狀不規則緊湊，功能基團相對于線性聚合物更多，因此具有溶解性增強、低黏度、低結晶性和高穩定性[10]。通常采用生物相容性/可降解聚合物分支組成星形結構，如聚丙交酯（PLA）、聚己內酯（PCL）、聚乙二醇（PEG）、聚甲基丙烯酸羥基乙酯等制成具有兩親性的核殼結構的大分子聚合物，用于疏水性藥物分子的包載/控釋[11]。

據此，本文通過開環聚合（ROP）和原子轉移自由基聚合（ATRP），設計合成了兩種兩親性六臂星形聚己內酯-b-聚甲基丙烯酸羥基乙酯（6sPCL-b-PHMEA）和聚己內酯-b-聚甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯-b-聚甲基丙烯酸羥基乙酯（6sPCL-b-PDEAM-b-PHEMA），將星形共聚物在水溶液中組裝成大分子膠束，研究其載藥性能及在不同pH環境下的藥物控釋動力學。

1? 實驗部分

1.1? 儀器與試劑

TENSOR 27傅里葉變換紅外光譜儀，德國布魯克公司;LS55熒光分光光度計，美國Perkin Elmer 公司;Nano ZS ZEN3600馬爾文激光粒度儀，英國馬爾文儀器;FD-1000冷凍干燥機，東京理化器械株式會社;DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司;RE-2000A旋轉蒸發儀，鞏義市予華儀器有限責任公司;SHA-C數顯水浴恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司。

ε-己內酯（ε-CL，99%）、2-溴異丁酰溴（98%）、五甲基二乙烯基三胺（PMDETA，99%）、甲基丙烯酸羥基乙酯（HEMA，98%）、甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯（DEAM，99%）、鹽酸阿霉素（DOX?HCl，98%）、辛酸亞錫[Sn（Oct）2，95%]和CuBr，購自阿拉丁試劑有限公司;雙季戊四醇（98%），購自上海麥克林生化科技有限公司;常規試劑如二氯甲烷（DCM）、四氫呋喃（THF）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）和二甲基亞砜（DMSO）等，均為分析純。

1.2? 實驗方法

1.2.1? 星形共聚物6sPCL-b-PHEMA的制備

1）羥基封端聚己內酯（6sPCL-OH）的合成（采用ROP法）：將0.085 g雙季戊四醇、4.43 mL ε-CL和Sn（Oct）2（質量分數為0.1%的ε-CL）加入50 mL燒瓶中減壓干燥2 h，氮氣保護下將混合物在120 ℃反應24 h。結束后用少量DCM溶解，冷甲醇沉降3次，將沉淀真空干燥得6sPCL-OH 3.84 g。

2）溴封端聚己內酯（6sPCL-Br）的合成：將2.5 g 6sPCL-OH溶于35 mL DCM，加入1.0 mL三乙胺，冷卻至0 ℃，在氮氣保護下將溶于10 mL DCM的異丁酰溴（1.0 g）溶液緩慢滴加至上述混合液中，室溫攪拌48 h。反應結束后，分別用5% NaHCO3（3×30 mL）和飽和NaCl溶液（3×30 mL）洗滌，無水硫酸鈉干燥，冷石油醚沉降3次，真空干燥得到產物6sPCL-Br 2.12 g。

3） 6sPCL-b-PHEMA的合成（采用ATRP法）：在Schlenk瓶中依次加入0.20 g 6sPCL-Br，4 mL? 1，4-二氧六環，0.04 g CuBr，HEMA 0.30 g和42 ?L PMDET后將混合物冷凍-抽真空-充氮氣-解凍循環3次，60 ℃反應24 h，反應結束后，通空氣淬滅反應。以DCM為洗脫劑，通過中性氧化鋁柱除去CuBr，減壓除去溶劑，用冷石油醚沉降3次，真空干燥得產物6sPCL-b-PHEMA（圖1a） 0.207 g，保存備用。

1.2.2 星形共聚物6sPCL-b-PDEAM-b-PHEMA的制備

以6sPCL-Br為引發劑，DEAM為功能性單體，CuBr為催化劑，PMDETA為配體，通過ATRP反應合成6sPCL-b-PDEAM;以6sPCL-b-PDEAM為引發劑，HEMA為單體，CuBr為催化劑，PMDETA為配體，合成6sPCL-b-PDEAM-b-PHEMA（圖1b）。具體方法同1.2.1中第3種，經過兩次ATRP反應，最終得到產物0.122 g，保存備用。

1.3? 大分子膠束的構建

分別將兩種星形共聚物（1 mg 6sPCL-b- PHMEA和1 mg 6sPCL-b-PDEAM-b-PHEMA）溶解并分散于1 mL THF中，并在室溫下攪拌30 min，緩慢滴加400 μL蒸餾水以形成膠束，繼續攪拌30 min后加入4 mL水，減壓濃縮除去THF和部分水，將體積定容至2 mL，得空白膠束。

1.4? 膠束的載藥性能

1.4.1? 載藥量的測定

以DOX為模型藥物制備載藥膠束：分別將10 mg兩種星形共聚物溶于250 μL DMF和750 μL THF混合溶劑中;將3 mg DOX?HCl溶于250 μL DMF中，再加入一滴TEA中和HCl;將上述DOX的DMF溶液與聚合物溶液混合并攪拌10 min，緩慢滴入5 mL水中攪拌30 min形成聚合物膠束，減壓除去THF。將溶液轉移到透析袋中（截留相對分子質量? ? ? ?8 000 ～14 000），在蒸餾水中透析12 h以去除未包載藥物和溶劑，最后定容至10 mL。

取0.2 mL載藥膠束加入2 mL混合溶劑? ? ? [V（DMF）∶V（DMSO）=1∶1]充分溶解，采用熒光分光光度計測定膠束載藥量，定激發波長為? ?470 nm，測定發射波長588 nm處的熒光強度。按公式（1）計算載藥膠束的載藥量（Y1）。

1.4.2 載藥膠束的體外釋藥性能

以pH為7.4、5.0、2.2三種緩沖液作為釋放介質，考查載藥膠束的釋藥動力學：分別將2 mL二嵌段、三嵌段載藥膠束轉移到透析袋中（截留相對分子質量8 000～14 000），放入20 mL透析液，在37 ℃下進行藥物釋放，每隔一段時間取2 mL透析液，并補充等量的釋放介質，用熒光分光光度計測定DOX的累積釋放量，以時間為橫坐標，累積釋藥率為縱坐標，繪制藥物釋放動力學曲線。

1.5? 結構表征

紅外表征：分別取微量樣品與光譜純溴化鉀充分研磨后壓片，通過傅里葉變換紅外光譜儀測定其FT-IR。

粒徑和粒徑分布（PDI）：取1 mL空白膠束用水定容至100 mL，超聲30 min，采用馬爾文激光粒度儀測定其粒徑及粒徑分布。

2? 結果與討論

2.1? FT-IR表征

圖2為星形共聚物各步產物的FT-IR圖，從圖譜中可以看到3 400 cm-1附近的寬吸收帶為—OH的特征峰，2 850～2 950 cm-1為—CH2上C—H的反對稱伸縮和對稱振動峰，1 700 cm-1附近為酯羰基伸縮振動峰，1 360～1 450 cm-1為—CH2上C—H的變角振動峰，1 150～1 290 cm-1為CH2烷烴扭曲振動峰，? ? 723 cm-1為4個以上CH2鏈具有的特征峰。6sPCL-b- PHEMA圖譜中可以明顯看到—OH特征峰變寬、變強，證明了HEMA單體的引入，6sPCL-b-PDEAM -b-PHEMA圖譜中也有相應基團的特征吸收峰，如羰基、CH2、CH3、—OH等，C—N伸縮振動在? ? ? ? 1 230～1 030 cm-1區域，與CH2特征峰重疊。

2.2? 膠束的粒徑和粒徑分布

圖3為兩種共聚物膠束的粒徑分布圖，其中二嵌段膠束平均粒徑為205.0 nm（PDI=0.135），三嵌段膠束平均粒徑為230.4 nm（PDI=0.180），可見兩種膠束粒徑分布較為均勻，并且這些膠束大小允許通過EPR效應在腫瘤中外滲和積聚，可用于抗癌藥物的釋放。三嵌段共聚物膠束的粒徑略大于二嵌段共聚物膠束，這可能是由于DEAM的加入導致膠束粒徑的增大。

2.3? 膠束的載藥性能

實驗采用透析法制備了載藥膠束，并采用熒光分光光度法測定膠束載藥量，其中DOX在混合溶劑[V（DMF）∶V（DMSO）=1∶1]中的標準曲線為I = 8.813 9ρ+7.959 4 （r =0.998 4），線性范圍為0～20 μg·mL-1。利用DOX在混合溶劑中的標準曲線和公式（1）測得6sPCL-b-PHEMA和6sPCL-b-PDEAM- b-PHEMA載DOX膠束的載藥量分別為11.56%和14.23%。結果表明，三嵌段聚合物的載藥量高于二嵌段聚合物，這可能由于DEAM是疏水基，增加了結構中疏水鏈的長度從而提高載藥量。

2.4? pH敏感藥物釋放性能

采用熒光分光光度法測定膠束的累積釋藥率，其中DOX在水溶液中的標準曲線為I=60.503 9ρ+ 7.448 7（r =0.997 8），線性范圍為0～10 μg·mL-1。圖4為不同pH介質下DOX從兩種載藥膠束中釋放的動力學過程，可見，pH的變化對二嵌段膠束的藥物釋放影響較小，而對三嵌段膠束的藥物釋放有顯著影響，隨著pH值從7.4降至2.2，三嵌段膠束的DOX累積釋藥率逐漸增加，在pH=2.2時14 h累積釋藥率可達到約80%，具有顯著的酸敏感性。這是由于在酸性條件下可使DEAM中的叔胺基團發生質子化，增加了膠束尺寸，進而導致DOX的釋放速率加快。

3? 結 論

1）采用ROP和ATRP反應合成了兩種兩親性六臂星形共聚物6sPCL-b-PHMEA和6sPCL-b- PDEAM-b-PHEMA，并通過FT-IR對其結構進行了表征。

2）兩種共聚物能在水介質中自組裝成膠束，均具有合適的粒徑和粒徑分布，采用透析法將DOX載入聚合物膠束，測得6sPCL-b-PHEMA和6sPCL- b-PDEAM-b-PHEMA膠束的載藥量分別為11.56%和14.23%。

3）研究了不同pH介質（pH=7.4、5.0、2.2）環境下兩種載藥膠束的釋放動力學，研究發現，與星形共聚物6sPCL-b-PHEMA相比，星形共聚物6sPCL-b-PDEAM-b-PHEMA具有顯著的pH敏感性。

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