核桃不同時期葉片及不同組織RNA提取方法篩選

陳 浩，安瑞云，常青山，王 梓，毛星夜

(1. 河南科技大學林學院，河南 洛陽 471000；2. 洛陽市隋唐城遺址植物園，河南 洛陽 471002)

核桃（Juglans regia L.）含有大量易消化的脂肪（60%～75%）、蛋白質(zhì)（約20%）和糖類（約10%）。此外，還含有其他有益的營養(yǎng)成分，如磷、鉀、鐵、鈣、鎂、錳等以及多種維生素、多酚、類黃酮、磷脂、花青素等功效成分，是世界公認的保健食品[1]。近年來，轉錄組測序、Northen雜交，cDNA文庫構建、逆轉錄PCR、基因克隆等分子生物學手段日益普及，提取總RNA是從基因組學入手研究核桃生長和代謝過程的基礎環(huán)節(jié)[2-3]。諸多研究表明，多糖易與RNA在提取過程中形成共沉淀，使RNA埋在多糖形成的粘稠難溶的膠狀物中難于分離，且發(fā)生降解，嚴重影響RNA的產(chǎn)量和質(zhì)量[4-5]；而酚類化合物的含量較高，則極易被氧化為醌類物質(zhì)，導致RNA失活，產(chǎn)量降低[6]。因此，多糖和多酚等次生代謝物等在核桃體內(nèi)廣泛大量存在，導致一般提取方法效率低下，難以獲得可靠核桃RNA。另外，植物組織特異性也會影響提取效果，植物不同時期不同組織，由于上述干擾物質(zhì)積累不同[7]，同一方法提取效果差異巨大。因此，有必要對核桃進行RNA提取方法篩選優(yōu)化，進而對不同時期不同組織有針對性的改良。

目前，關于核桃總RNA的提取方法已有報道，其研究主要是針對核桃芽[8]、胚[9]、葉片[10]總RNA提取方法的比較，但對于同一組織的不同發(fā)育時期以及同一種植物的不同組織總RNA提取方法的篩選和優(yōu)化還未見報道。本研究采用改良硼砂—CTAB法、改良硼砂—CTAB—異丙醇法、改良SDS法、改良Trizol法Ⅱ以及試劑盒法分別提取核桃幼嫩葉片，成齡葉片和衰老葉片的總RNA，并將篩選出的改良硼砂—CTAB法、改良硼砂—CTAB—異丙醇法分別提取核桃胚、葉柄、韌皮部、雄花的總RNA，以期找到從核桃不同發(fā)育時期葉片以及不同組織中提取總RNA的最佳方法，為后續(xù)開展核桃的分子生物學等研究工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

供試材料選自河南科技大學林學院實驗基地，核桃品種為“晉中2號”，分別于2019年4月下旬、7月中旬、9月下旬隨機從樹的不同方位挑取幼嫩葉片，成齡葉片和衰老葉片；5月初采集雄花、葉柄和韌皮部；果實發(fā)育期采集實驗用胚；立即液氮速凍，帶回實驗室置于-80℃冰箱中保存。

試驗所用試劑有CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）、SDS(十二烷基苯磺酸鈉)、PVP–40 (聚乙烯吡咯烷酮)、DEPC（焦炭酸二乙酯）、LiCl，均來自上海滬試實驗室器材股份有限公司。提取RNA的試劑用經(jīng)高壓滅菌的0.1% DEPC水直接配置。Trizol試劑、RNA plant plus Reagent植物總RNA提取試劑盒、PrimeScriptTM1stStrand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒均購自寶生物工程有限公司。

1.2 試驗方法

試驗中所用的離心管、槍頭、槍頭盒等塑料器皿經(jīng)0.1% DEPC水37℃浸泡過夜后于121℃高溫高壓滅菌40 min后使用，研缽、藥匙、玻璃器皿等用錫箔紙包好后置于180℃烘箱中滅菌8 h。試驗均設置3次重復，涉及提取方法如下。

1.2.1 改良硼砂—CTAB法 參照宋艷波等[8]方法提取，并進行了部分優(yōu)化。將硼砂—CTAB提取緩沖液（0.025 mol·L-1硼砂（pH 8.5）；1.5 mol·L-1NaCl；2% CTAB；0.1% Vc；1% DTT；250 mg·L-1糖原）于65℃水浴中溫育30 min，其余步驟相同。

1.2.2 改良的硼砂—CTAB—異丙醇法 參照王艷等[3]方法提取，并進行了部分優(yōu)化。在1.5 mL離心管中加入1 000 μL提取緩沖液（0.025 mol·L-1硼砂（pH 8.5）；1.5 mol·L-1NaCl；2% CTAB；0.1%Vc；1% DTT；250 mg·L-1糖原）于65℃水浴中溫育30 min后加50 μL β-巰基乙醇，其余步驟相同。

1.2.3 改良SDS法 參照孟曉慶等[11]方法提取。

1.2.4 改良Trizol法Ⅱ 參照王其海等[12]方法提取。

1.2.5 試劑盒法 按照寶生物工程有限公司的RNA plant plus Reagent植物RNA快速提取試劑盒說明書進行（此試劑盒主要針對多糖多酚類植物設計）。

1.3 總RNA質(zhì)量檢測

1.3.1 總RNA完整性檢測 分別取3 μL總RNA在1.0%普通瓊脂糖凝膠電泳上進行電泳檢測，125 V恒壓電泳20 min，EB染色后在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照記錄，根據(jù)28S、18S、5S條帶的清晰度和相對含量評估總RNA的完整性。

1.3.2 總RNA濃度和純度的檢測 取1 μL總RNA樣品，用NanoDrop ND–2000c型超微量紫外分光光度計檢測RNA濃度以及OD260/OD280、OD260/OD230值和RNA產(chǎn)率。

1.3.3 RT–PCR檢測 按照PrimeScriptTM1stStrand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒說明進行反轉錄。根據(jù)內(nèi)參基因18S核糖體RNA（18S rRNA）基因[13]和核桃翻譯起始因子（JreIF1A）序列[14]，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物(表1)。擴增條件：95℃預變性2 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)，最后72℃總延伸10 min。將PCR擴增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。引物合成和基因測序委托上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.4 篩選出的總RNA提取方法對核桃不同組織RNA的提取效果

為了進一步驗證篩選和優(yōu)化的提取方法是否也適用于核桃的其他組織。將優(yōu)選出的改良硼砂—CTAB法、改良硼砂—CTAB—異丙醇法分別提取核桃胚、葉柄、韌皮部、雄花的RNA并進行同上檢測。

表 1 RT–PCR檢測引物信息 Table 1 Primers used for RT-PCR

2 結果與分析

2.1 不同發(fā)育時期核桃葉片總RNA的完整性比較

2.1.1 幼嫩葉片和成齡葉片 核桃幼嫩葉片中除了改良SDS法，其他方法均獲得了不同品質(zhì)的RNA。改良SDS法雖然操作步驟簡單，但實驗結果不理想，未提取出RNA(圖1E)。改良Trizol法Ⅱ呈現(xiàn)28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA 3條帶明亮，但條帶有拖尾現(xiàn)象，點樣孔附近發(fā)亮，說明有RNA降解并存在蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)污染，DEPC處理水溶解沉淀時溶液黏稠(圖1A)。試劑盒法提取的RNA條帶較暗，且5S rRNA條帶不明顯（圖1B）。改良硼砂—CTAB—異丙醇法和改良硼砂—CTAB法均提出了28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA 3條帶（圖1C、D），相比較而言，改良硼砂—CTAB—異丙醇法的5S rRNA條帶亮度較弱，改良硼砂—CTAB法提取的總RNA點樣孔干凈，且28S rRNA亮度大約是18S rRNA的2倍，說明提取過程中沒有降解的發(fā)生，DNA和蛋白質(zhì)、多糖污染少，分析后發(fā)現(xiàn)優(yōu)化的效果很明顯。成齡葉片中5種方法都獲得了核桃總RNA，改良Trizol法Ⅱ提取到的28S rRNA和18S rRNA條帶最亮，而且兩條帶寬度相當，但在點樣孔處仍然發(fā)亮(圖1J)。試劑盒法和改良SDS法28S rRNA和18S rRNA 2條帶較暗（圖1G、I），5S rRNA都不明顯。改良SDS法提取物中有DNA殘留。改良硼砂—CTAB法28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA 3條帶明亮、清晰、無拖尾，所提取的總RNA完整性好且無明顯降解（圖1H）。

圖 1 不同方法提取核桃幼嫩葉片和成齡葉片總RNA的凝膠電泳檢測Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA extracted from young and mature leaves of Juglans regia L. by different methods

2.1.2 衰老葉片 進入衰老期的葉片提取時，通過肉眼觀察沉淀發(fā)現(xiàn)：改良Trizol法Ⅱ、改良SDS法、改良硼砂—CTAB法提取的RNA沉淀均為淺褐色，并且溶解后溶液黏稠易拉絲狀；改良硼砂—CTAB—異丙醇法和試劑盒法沉淀均為白色；改良Trizol法Ⅱ和改良SDS法點樣時，都存在不同程度的“漂樣”現(xiàn)象。凝膠電泳結果（圖2）顯示：除改良硼砂—CTAB—異丙醇法（圖2C～E）外，其他4種方法（圖2A、B、F、G）均有明顯的拖尾和降解現(xiàn)象，提取效果差。改良Trizol法Ⅱ（圖2F）提取與幼葉、成齡葉片相似，依然存在蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)污染。

2.2 不同發(fā)育時期核桃葉片總RNA質(zhì)量濃度和純度的比較

圖 2 不同方法提取核桃衰老葉片總RNA的凝膠電泳檢測Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of total RNA extracted from senescing leaves of Juglans regia L. by different methods

改良硼砂—CTAB法和改良硼砂—CTAB—異丙醇法提取幼嫩葉片和成齡葉片總RNA的OD260/OD280為1.9～2.1，OD260/OD230值大于2.0，說明其純度較好；相較質(zhì)量濃度而言，改良硼砂—CTAB法比改良硼砂—CTAB—異丙醇法提取濃度更高（表2）；改良Trizol法Ⅱ提取的這2個時期葉片質(zhì)量濃度最高，但OD260/OD280都小于1.8，說明有蛋白質(zhì)污染。核桃衰老葉片總RNA的純度和質(zhì)量濃度，只有改良硼砂—CTAB—異丙醇法的OD260/OD280和OD260/OD230值在標準范圍內(nèi)，說明雜質(zhì)去除較為徹底。5種不同方法提取的總RNA純度通過比較OD260/OD280和OD260/OD230平均值進行評估，如圖3所示：改良Trizol法Ⅱ、改良SDS法和試劑盒法提取總RNA的OD260/OD280值均低于2.0；改良硼砂—CTAB法和改良硼砂—CTAB—異丙醇法提取總RNA的OD260/OD280值都超過2.0；改良SDS法和試劑盒法提取總RNA的OD260/OD230值遠小于2.0；其他3種方法均超過2.0。因此，綜合比較5種方法，改良硼砂—CTAB法和改良硼砂—CTAB—異丙醇法對于不同時期葉片提取平均效果最好，OD260/OD280和OD260/OD230值均在2.0以上，符合RNA提取要求，總RNA純度更好。

表 2 不同方法提取不同發(fā)育時期核桃葉片總RNA純度和質(zhì)量濃度Table 2 The purity and concentration of the total RNA with different kinds of RNA extraction method in different tissues

2.3 篩選與優(yōu)化的2種方法對核桃其他組織總RNA的提取效果

利用優(yōu)選出的改良硼砂—CTAB法和改良硼砂—CTAB—異丙醇法分別提取核桃胚、葉柄、韌皮部、雄花的總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果（圖4）顯示：改良硼砂—CTAB法最適合葉柄和雄花的提取，獲得的條帶清晰、完整、無拖尾。對于胚和韌皮部的提取并不理想，28S和18S存在彌散嚴重、拖尾和降解，多糖和蛋白質(zhì)等污染。改良硼砂—CTAB—異丙醇法則提取胚和韌皮部的效果較好，點樣孔處無亮斑，無DNA的污染，條帶的亮度與清晰度達到要求。

圖 3 不同方法提取RNA OD比值平均值Fig. 3 The average values of RNA OD ratio by different methods

圖 4 2種方法對核桃其他不同組織總RNA提取的效果Fig. 4 The effect of total RNA extracted from different tissues of Juglans regia L. by two methods

2.4 核桃總RNA的RT—PCR檢測

將改良硼砂—CTAB法提取的核桃幼嫩葉片、成齡葉片、葉柄和雄花；改良硼砂—CTAB—異丙醇法提取的核桃衰老葉片、胚和韌皮部總RNA進行電泳檢測，如圖5所示：28S、18S、5S條帶明亮。經(jīng)反轉錄，并設計內(nèi)參基因18S核糖體RNA基因（18S rRNA）和核桃翻譯起始因子（JreIF1A）引物，以反轉錄產(chǎn)物為模板進行擴增后電泳檢測，驗證所提RNA能否滿足后續(xù)試驗要求。PCR產(chǎn)物電泳結果（圖6），在Mark 500 bp附近獲得明亮的特異目的條帶，與預期的基因片段大小一致。為進一步保證試驗結果的準確性，將JreIF1A引物所擴增片段測序經(jīng)比對與JreIF1A（NCBI基因號：XM018972344.1）的ORF基因序列完全一致，說明這2種方法提取的總RNA能用于后期的分子生物學試驗。

圖 5 2種方法提取不同組織總RNA電泳圖Fig. 5 Agarose gel electrophoresis of total RNA extracted from different tissues by two methods

圖 6 2種方法提取的核桃總RNA的RT-PCR檢測結果Fig. 6 The RT-PCR results of total RNA extracted by two methods

3 討論

目前，關于如何獲得高質(zhì)量木本植物總RNA的方法已經(jīng)有大量的探索與研究，但實踐證明沒有一種方法是通用的。主要因為不同RNA提取方法對不同發(fā)育時期，不同器官及不同組織的提取效率不盡相同[15]。核桃屬于多年生木本植物，且不同時期組織結構和組成上存在異質(zhì)性，特別是多糖、多酚、蛋白質(zhì)等次生代謝物在不同組織中互有差異，且隨著個體不斷成熟，同一組織內(nèi)源、外源RNA酶含量逐漸豐富，各種水解酶大量積累，多酚和多糖的含量也隨之增加[16]。在完整的植物細胞中，這些物質(zhì)與核酸是分離的，但在提取過程中細胞碎裂，即與RNA相互作用以復合體形式存在，導致各組織RNA提取過程中出現(xiàn)質(zhì)量差、產(chǎn)量低、容易降解等問題[17-18]。因此，為確保獲得高質(zhì)量的RNA以應用于后續(xù)分子生物學試驗，有必要針對核桃不同發(fā)育時期及組織篩選出最佳RNA提取方法。

研究發(fā)現(xiàn)，改良硼砂—CTAB法對于幼嫩葉片和成齡葉片均有較好的RNA提取效果；而改良SDS法僅適用于成齡葉片，未能提取幼嫩葉片中的RNA。改良SDS法步驟簡單，在去除核桃多糖干擾方面效果較好，但對于解決幼嫩葉多酚物質(zhì)的干擾能力方面較弱，從而無法從組織中提取出完整的RNA[19]。而改良硼砂—CTAB法，不僅可以高效去除多糖干擾，對幼葉當中的酚類等干擾物也有很好的清除作用。改良硼砂—CTAB提取液中1.5 mol·L-1的高濃度NaCl和CTAB共同作用可以高效除去多糖雜質(zhì)，避免在溶解時易與RNA一起沉淀，溶解后呈黏稠狀的膠質(zhì)溶液[20-21]；而在研磨過程中加入PVPP，可以主動吸附酚類、蛋白質(zhì)等，形成螯合物，避免酚類與RNA結合，同時Vc和DTT也可以防止提取過程中酚類物質(zhì)氧化的發(fā)生[8]。另外，CTAB是一種強烈的去垢劑，可以很好的打破植物細胞，釋放核酸，并對蛋白的變性凝聚有很強的效果[9]，進一步提高提取效率。

改良硼砂—CTAB—異丙醇法更適用于對衰老葉片的提取，其他4種方法不同程度地存在降解或多糖、蛋白質(zhì)污染等現(xiàn)象。多數(shù)落葉樹種在生長季的后期會積累更多的糖類物質(zhì)[22]，組織衰老后會比幼嫩組織積累更多的酚類物質(zhì)，因此，改良硼砂—CTAB—異丙醇法在操作過程中，除改良硼砂—CTAB的干擾物質(zhì)的去除辦法外，另外加入了大量的抗氧化劑β-巰基乙醇，避免氧化，同時增加多次加氯仿抽提，這樣使得組織更充分地分散在試劑中使乳化更充分，有效抑制RNA酶RNA降解作用，并且可以更好地去除蛋白質(zhì)和雜質(zhì)[23]。改良硼砂—CTAB—異丙醇提取液在低溫存放時易形成白色固體顆粒，加長65℃水浴中溫育時間，可以使白色固體顆粒充分溶解，樣品更充分地分散在試劑中，很好的發(fā)揮其藥效。

改良硼砂—CTAB—異丙醇法對于胚、韌皮部也有較高的提取效率。核桃胚因富含多糖、油脂（含量高于其他組織）和蛋白質(zhì)以及其它次生代謝物質(zhì)，多酚、色素等物質(zhì)在提取過程中易被氧化導致褐變，導致RNA失去活性[24-25]，改良硼砂—CTAB—異丙醇法通過螯合劑、抗氧化、表面活性劑（CTAB）、選擇性沉淀RNA（LiCl）[26-27]、多次抽提等措施可以很好解決。果樹韌皮部的組織木質(zhì)化程度高，細胞壁較厚[28]，導致細胞裂解不完全，可能是提取效率低下的重要原因，因此，改良硼砂—CTAB—異丙醇提取液中加入10% PVPP，β-巰基乙醇與材料共研磨，多次抽提、加長裂解時間，避免氧化同時完全裂解[29]，最終取得較好的提取效果。另外，改良硼砂—CTAB法操作時間相對較短，提取葉柄和雄花的RNA條帶清晰，品質(zhì)佳；而改良硼砂—CTAB—異丙醇法雖然也能提取出完整的RNA，但質(zhì)量濃度較小，可能主要是由于多次抽提，操作時間相對較長導致RNA產(chǎn)量降低。

改良硼砂—CTAB法與改良硼砂—CTAB—異丙醇法，針對文中不同核桃組織多糖、酚類、蛋白質(zhì)等干擾物含量高、組織結構差異性等特點，有針對性的進行了改良，有較好的普遍適用性，而且相對經(jīng)濟高效。二者有較高的相似性，改良硼砂—CTAB—異丙醇法耗時更長，操作更復雜，但對于難提取的胚、韌皮部等部位有更好的提取效果，實際操作可以同時多組進行，提高效率。本研究篩選優(yōu)化的2種方法創(chuàng)新性尤其在于考慮到同一組織不同時期組織的特異性提取需求。試劑盒法雖然基于多糖植物組織開發(fā)，操作簡單便捷且耗時較短，但因為上述各種核桃組織存在不同的組織結構特異性，不同的發(fā)育程度以及不同的內(nèi)含干擾物種類及含量，決定了試劑盒法不可能適用于所有植物組織的高效提取要求，其成本也較高，大約是改良硼砂—CTAB試劑的3倍。采用試劑盒法提取的樣品普遍存在質(zhì)量濃度較低的現(xiàn)象，試驗結果表明提取濃度只有2種CTAB方法的1/2左右，后期降解，不利于后續(xù)實驗。

4 結論

綜上所述，在核桃總RNA提取時以改良硼砂—CTAB法和改良硼砂—CTAB—異丙醇法為宜，但同時要根據(jù)不同發(fā)育時期葉片及不同組織的生理特性選擇適宜的方法，才能更好為后續(xù)的分子生物學研究奠定基礎。