乳酸菌調控骨骼肌線粒體生物發生的機制研究進展

白艷蘋，侯艷茹，侯普馨，孫 冰，趙麗華，巴吉木色，靳 燁，蘇 琳,*

（1.內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018；2.烏拉特中旗農牧和科技局，內蒙古 烏拉特中旗 015300）

骨骼肌由具有不同收縮與代謝特性的肌纖維組成，肌纖維類型的差異會導致骨骼肌生理與代謝特征上的差異，進而引起肉品質的差異。動物骨骼肌肌纖維的組成并不是固定不變的，它們會隨著骨骼肌對代謝與功能需求的改變而發生轉化，且這種轉化易受到營養、運動和激素等多種因素的影響，是一個非常復雜的調控過程。作為調控骨骼肌纖維類型的新介質，線粒體生物發生與肌纖維的氧化能力密切相關，在骨骼肌纖維的轉化和生長發育中發揮重要作用。相關研究已經表明，乳酸菌可通過誘導線粒體生物發生中關鍵基因的表達、上調線粒體基因的轉錄水平、參與多種信號通路從而調控線粒體生物發生[1-2]。因此本文旨在闡述乳酸菌調控線粒體生物發生的分子機制，線粒體生物發生與肌纖維類型轉化和肉品質之間的關系，并對乳酸菌通過調控線粒體生物發生影響肌纖維類型轉化，進而改善肉品質的研究方向進行展望。

1 線粒體與線粒體生物發生概述

關于線粒體的研究至今已有100多年的歷史。線粒體是細胞生物氧化磷酸化的重要場所，在線粒體三羧酸循環中，由乙酰輔酶A氧化生成的還原等價物（還原型輔酶I（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）和黃素腺嘌呤二核苷酸遞氫體（flavine adenine dinucleotide,reduced，FADH2）通過電子傳遞系統被氧化為水，在具有線粒體的細胞中產生大量ATP，這些ATP是骨骼肌收縮的能量來源[3]。除了為機體提供大部分能量外，線粒體氧化磷酸化系統還會對細胞糖酵解過程產生影響，從而決定宰后肉品質的形成[4]。線粒體與肉中肌紅蛋白的氧化還原狀態密切相關，它主要通過影響氧氣消耗和高鐵肌紅蛋白還原來改變肉色及其穩定性，因此影響線粒體結構和功能的因素也會影響肉色[5]。此外，線粒體會釋放激活細胞凋亡酶的因子，使其參與細胞凋亡，加速肌原纖維蛋白的降解，從而提高肌肉嫩度[6]。當機體的線粒體受損后會嚴重影響線粒體功能，降低肌肉蛋白質的合成代謝速率和ATP的合成，導致肌纖維的死亡和肌肉質量的損失，并最終影響肉品質[7-8]。可見，線粒體網絡穩態對畜禽宰后肉品質的形成有重要作用，因此，在長期進化過程中，機體形成了一套完善的機制，即線粒體質量控制來保證線粒體數量及質量的相對穩定，包括線粒體生物發生、動態變化（融合分裂）及自噬3 個階段，其中線粒體生物發生起著至關重要的作用。

盡管文獻中廣泛使用“線粒體生物發生”（mitochondrial biogenesis）或“線粒體生物合成”這一名詞，但目前人們并沒有對此給出明確的定義，可見對于線粒體生物發生，人們還缺乏一個清晰的認識。簡言之，線粒體生物發生是指骨骼肌在生理和病理條件下表現出的一種適應能力，其結果導致骨骼肌線粒體質量或數量的增加[9]。然而，線粒體生物發生過程相對復雜，主要是因為線粒體是具有自身基因組的半自主遺傳細胞器，線粒體生物發生依賴于線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）和核DNA（nuclear DNA，nDNA）的共同調控。mtDNA呈雙鏈環狀，一個線粒體中可有1 個或多個DNA分子，mtDNA編碼了線粒體電子傳遞鏈復合物I、III和IV的13 個亞基，雖然比nDNA小得多，但其編碼的13 種多肽在線粒體功能中具有重要作用。線粒體生物發生和功能完成大約需要1 500多種多肽，除了mtDNA外，其他的均由nDNA轉錄、翻譯，并通過蛋白輸入機制轉運到線粒體內。nDNA不僅編碼線粒體蛋白的表達，還編碼了參與線粒體生物發生的轉錄因子。

2 調控線粒體生物發生的關鍵基因

當機體受到運動、營養或骨骼肌收縮等刺激時，細胞內Ca2+濃度和AMP水平增加，導致信號分子活化，這些活化的信號傳導途徑聚集在過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma co-activator-1α，PGC-1α）上，以促進線粒體生物發生（圖1）。

圖1 線粒體生物發生模型[9]Fig. 1 A proposed model of mitochondrial biogenesis[9]

2.1 過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α

PGC-1α是一種重要的核受體輔助激活因子，它能夠促進線粒體基因的表達，因此也被認為是線粒體生物發生的主要調節因子。作為線粒體代謝基因的上游誘導劑，PGC-1α與轉錄因子相互作用，上調NFR-1和NFR-2的轉錄水平，其中NFR-1能誘導線粒體基因組區段的表達，特別是編碼氧化磷酸化組分和線粒體核糖體蛋白的基因[10]。同時PGC-1α對NRF-1和NRF-2的共激活刺激TFAM的表達，從而參與線粒體生物發生過程中mtDNA的轉錄、復制及擬核的形成[11]。此外，PGC-1α誘導參與氧化磷酸化基因的表達，使其參與電子傳遞鏈和ATP合成的最后步驟，從而使脂肪酸完全氧化成線粒體中的水和二氧化碳[12]。可見，PGC-1α協調線粒體生物發生中核和線粒體編碼基因的表達，在線粒體生物發生中至關重要。

2.2 沉默信息調節因子

SIRTs是一系列NAD+依賴性組蛋白去乙酰酶，其活性受細胞內NAD+/NADH比值的控制，當NAD+水平升高時SIRTs被激活[13]。研究發現，在人和小鼠中存在7 種SIRTs，其中SIRT1、SIRT3和SIRT5在線粒體生物發生中發揮作用，可動態調節線粒體功能[14]。SIRT1是刺激骨骼肌線粒體生物發生所必需的。Price等利用小鼠實驗研究發現，白藜蘆醇可以顯著增加線粒體生物發生和線粒體功能，但特異性敲除SIRT1基因后再用白藜蘆醇處理，并沒有觀察到線粒體功能改善和線粒體生物發生增加[15]。該結果說明，SIRT1在線粒體生物發生中起著至關重要的作用，可以通過某些手段刺激SIRT1的高表達，從而改善線粒體功能。此外，Gerhart-Hines等的研究也表明，SIRT1可通過去乙酰化和激活PGC-1α來促進線粒體生物發生[16]。在線粒體生物發生過程中，SIRT1誘導PGC-1α的激活，這對于協調核轉錄因子和核激素受體的激活至關重要，如PPARα、ERRα[17-18]，從而導致核編碼的線粒體基因的表達增強。據報道PGC-1α以PPARα和ERRα依賴性方式增加SIRT3和SIRT5的表達[19-20]。SIRT3可以調控線粒體的呼吸作用，增加細胞ATP水平，防止線粒體內活性氧（reactive oxygen species，ROS）自由基的過度產生，維持線粒體形態和結構穩定，并誘導線粒體生物發生[21]，而SIRT5可能對氧化磷酸化具有積極作用，影響線粒體功能。

2.3 腺苷酸活化蛋白激酶

AMPK是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是機體重要的能量感受器，也是介導線粒體生物發生的另一個關鍵因素。諸多表明，AMPK可以促進線粒體生物發生和氧化能力，并防止骨骼肌中的線粒體功能障礙[22]。一些研究者認為，由ATP水平變化引起的線粒體生物發生和AMPK的激活有關。2007年，Jager等提出運動、能量限制、骨骼肌收縮活動等外界刺激下，細胞內AMP/ATP比值增加可激活AMPK，活化的AMPK可直接磷酸化PGC-1α的Thr177和Ser538位點，進而促進線粒體生物發生[23]。此外，AMPK亦受細胞內Ca2+水平升高激活的CaMKKβ的影響而被磷酸化和激活。Chen Xiaoling等研究發現，EX527（SIRT1抑制劑）顯著降低了AMPK磷酸化水平，該結果表明，AMPK可能作為SIRT1的下游靶點[24]。SIRT1與AMPK進行正反饋循環，因為AMPK提高了細胞中的NAD+水平，從而增強SIRT1活性，進而促進其下游靶基因PGC-1α的表達，反過來激活的SIRT1可對LKB1去乙酰化使其活化，LKB1直接磷酸化AMPK的Thr172并最終導致AMPK激活[22,25]。

總地來說，活化的AMPK和SIRT1通過磷酸化和去乙酰化機制激活PGC-1α，促進線粒體生物發生和提高氧化能力，并防止骨骼肌中的線粒體功能障礙。

3 乳酸菌調控骨骼肌線粒體生物發生

以往人們對線粒體生物發生的研究主要集中在運動方面，關于乳酸菌調控線粒體生物發生的報道還較少。隨著研究的不斷深入，越來越多的證據表明，乳酸菌可以在骨骼肌細胞內產生多種信號轉導事件，這些信號通過改變關鍵分子的轉錄活性、mRNA的穩定性、蛋白質表達等，最終引起骨骼肌的線粒體生物發生。在乳酸菌引起的上述改變中，可能的作用途徑主要包括：骨骼肌細胞內激酶活化、ROS的信號誘導作用以及PGC-1α信號轉錄3 個方面（圖2）。

圖2 乳酸菌影響骨骼肌線粒體生物發生的信號通路Fig. 2 Signaling pathways by which lactic acid bacteria affect mitochondrial biogenesis in skeletal muscle

3.1 骨骼肌細胞內激酶活化

乳酸菌可以激活骨骼肌細胞內各種激酶活性，使激酶參與磷酸化。這些蛋白激酶包括CaMK、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等，它們激活各種轉錄因子及其輔助蛋白，啟動PGC-1α基因的表達，調控線粒體基因的轉錄。

2016年，Harada等研究表明，短乳桿菌T2102可以增強SIRT1表達[2]。作為AMPK和PGC-1α的上游誘導劑，SIRT1的高表達能激活AMPK和PGC-1α，促進線粒體生物發生。還有研究者提出，可將乳酸菌作為新型AMPK活化劑。Kim等的研究表明，植物乳桿菌發酵豆乳對大鼠肝臟AMPK磷酸化有促進作用，但其作用機制尚不清楚[26]。2018年，Lew等對此進行深入研究，通過體外細胞培養實驗證實了乳酸菌可提高AMPK磷酸化水平至與AMPK激活劑相似水平[27]。2019年，Hor等通過給老年大鼠飼喂乳酸桿菌后發現，乳酸桿菌可以降低葡萄糖和胰島素水平，從而激活AMPK，降低骨骼和肌肉中衰老基因標志物的表達，并增強大鼠的運動能力[28]。可見，乳酸菌可以不同程度地激活AMPK，提高其下游靶基因的表達，從而誘導線粒體生物發生。據Kobilo等報道，AMPK激活劑（AICAR）上調肌肉中的線粒體相關基因，與老年小鼠運動功能的改善相關[29]。以上研究結果說明乳酸菌菌株以AMPK依賴性方式參與骨骼肌線粒體生物發生。

除了激活AMPK表達外，乳酸菌代謝產生的大量乳酸還可以通過增加細胞內Ca2+濃度，提高鈣依賴蛋白激酶活性，參與線粒體生物發生。Hashimoto等的研究結果顯示，在骨骼肌L6細胞內加入20 mmol/L的乳酸增加了CaMKI和PKC的表達，潛在地增強了細胞對鈣的反應能力[30]。這可能是因為乳酸的大量積累使肌肉和血液p H 值下降，糖代謝受到抑制，AT P 生成減少，A D P 增多，AT P/A D P 比值下降，AMPK被激活。同時pH值的下降還影響了肌細胞膜對Na+、K+的通透性，導致肌細胞膜的超極化，肌質網內Ca2+水平升高。Ojuka等通過細胞培養的方法研究發現，咖啡因能刺激L6細胞胞漿內Ca2+水平升高，同時PGC-1α和TFAM蛋白表達增加，NRF-1和NRF-2與核DNA結合增強，誘導線粒體生物發生；當用阻斷劑阻斷Ca2+從肌質網中釋放時該過程被抑制，可見，Ca2+作為第二信使可調節線粒體生物發生[31]。Ca2+介導線粒體生物發生可能是通過鈣依賴蛋白激酶和磷酸化酶的活性。Ojuka等研究發現，低濃度的CaMK抑制劑就能完全抑制咖啡因引起的線粒體生物發生，這說明CaMK活性與線粒體生物發生密切相關[32]。在CaMKIV轉基因小鼠中，線粒體含量的增加與PGC-1α的表達增加有關[33]。因此，CaMKIV似乎通過PGC-1α發出信號，以促進骨骼肌中的線粒體生物發生。

3.2 活性氧的信號誘導作用

研究顯示，乳酸菌可引起線粒體ROS水平升高。2010年，Kim等研究發現，用不同濃度乳酸菌處理MCF-7乳腺癌細胞后，隨著乳酸菌濃度增加，ROS的產生量增多，且ROS的產生激活AMPK活性，促使癌細胞的COXII和mTOR的表達降低，從而誘導癌細胞凋亡[34]。因此得出結論，ROS是AMPK的上游信號，乳酸菌會顯著增加ROS的產生，激活AMPK，從而參與線粒體生物發生。2007年，Hashimoto等為探究運動訓練上調單羧酸轉運蛋白-1（monocarboxylate transporter-1，MCT1）表達的內在機制，將細胞在外源性乳酸存在下孵育，結果顯示，乳酸濃度的瞬時升高會使線粒體O2消耗加劇，刺激ROS的產生，從而激活NF-κB和NF-E2通路，導致MCT1表達增加[35]。NF-κB是一個普遍表達的轉錄因子，Bakkar研究發現，IκB激酶/NF-κB通過信號轉導抑制骨骼肌細胞分化，促進線粒體生物發生[36]。NF-E2通路與線粒體生物發生關系密切，其中NF-E2相關因子1-2對線粒體生物發生的促進作用已經得到大量研究證實。

ROS主要產生于線粒體，在細胞信號轉導中發揮著重要的作用，是機體應對氧化應激時的重要調控因子，這可能是因為ROS可以改變細胞氧化還原平衡狀態，從而緩解細胞氧化應激反應。據報道，ROS，特別是H2O2參與了包括PGC-1α在內的骨骼肌細胞基因表達的調控[37]。H2O2處理可通過增加小鼠成纖維細胞CREB的轉錄活性而增加PGC-1α的表達[38]。CREB是MAPK的組分因子，參與MAPK信號傳導途徑。有關心肌缺氧的研究顯示，心肌細胞缺氧增加了線粒體ROS的產生，ROS參與了適應性反應的信號轉導途徑，從而誘導p38 MAPK磷酸化[39]。該結果表明，作為線粒體生物發生中重要的信號通路，p38 MAPK的磷酸化是由于H2O2或超氧化物參與了該過程激活的，進而促進了骨骼肌線粒體生物發生。一些實驗證實，ROS可能作為一種第二信使在線粒體生物發生的信號傳導通路中起某種作用。2000年，Lee等研究發現，人的肺細胞在H2O2的作用下，線粒體的質量和mtDNA數量增加[40]。2002年，Lee等進一步證實，在人細胞復制性衰老過程中，ROS生成量增多，從而導致線粒體數量增加，他們同時還發現，用180 μmol/L H2O2處理復制性衰老細胞后，NRF-1和PGC-1α mRNA水平顯著升高[41]。可見線粒體產生的H2O2可能通過尚不完全清楚的通路到達細胞核，激活與線粒體生物發生有關的核基因，增加線粒體生物發生。除此之外，Pasquale等研究發現，乳酸誘導產生的H2O2還有可能增加細胞內鈣濃度，通過激活骨骼肌細胞內CaMK活性參與線粒體生物發生[42]。

但與此同時，還有一些研究結果表明，乳酸菌具有抗氧化作用，因此對ROS的產生有明顯抑制作用。2007年，Kumar等的研究表明，鼠李糖乳桿菌和擬桿菌屬細菌可控制腸道上皮細胞中ROS的生成并最終降低NF-κB的轉錄活性[43]。2017年，Chattopadhyay等也發現，乳酸菌能減少砷中毒引起的ROS的產生，并抑制NF-κB的活性[44]。可見，對于乳酸菌能否通過促進ROS的生成調控線粒體生物發生目前尚未有定論，仍需進一步深入研究。

3.3 PGC-1α信號轉錄

PGC-1α處于線粒體生物發生網絡系統的上游，是銜接外界刺激信號與線粒體內部功能調節的樞紐。PGC-1α由細胞信號級聯系統控制其激活、表達及信號傳遞，其上游的主要調控因子包括AMPK、p38 MAPK和CaMK。2019年，Jang給雄性小鼠飼喂清酒乳桿菌后發現，清酒乳桿菌可以誘導AMPK活化，提高SIRT1、PGC-1α的表達[1]。可見，乳酸菌可通過AMPK誘導PGC-1α激活、轉錄并促進其表達進而干預能量代謝。乳酸菌還可使參與p38 MAPK信號傳導的基因表達量增加，導致肌細胞增強因子2（myocyte enhancer factor 2，Mef2）和轉錄激活因子2激活并促進PGC-1α表達[45-46]。而CaMK通過其對應的磷酸化轉錄因子活化PGC-1α并促進其表達[47]。作為線粒體生物發生的主要調節因子，PGC-1α主要通過激活其下游NRF-1和NRF-2，進而促進TFAM的轉錄與表達。此外，PGC-1α還可以通過上調ERRα、PPARs等因子的表達進而提高SIRT3和SIRT5的轉錄水平，這對于調控線粒體生物發生十分重要。

眾所周知，乳酸菌在機體內代謝產生大量乳酸，目前學者們認為，代謝物乳酸可能直接作為信號分子物質調控PGC-1α的表達，進而影響骨骼肌線粒體生物發生。乳酸菌代謝產生的大量乳酸用于NAD+的產生，促進糖酵解過程，產生大量能量；同時NAD+的大量產生促進了SIRT1的表達，進而刺激PGC-1α的表達。作為穿梭機制的一部分，乳酸可以在形成的細胞內發揮作用，也可以輸出到鄰近的細胞、組織或器官中以供利用。2017年，孫景權等采用C2C12肌管細胞模擬研究乳酸對骨骼肌細胞線粒體功能的影響，結果表明，乳酸能誘導線粒體功能蛋白MCAT蛋白表達，增強MCAT活性，參與線粒體功能的維持[48]。其實早在此之前，Hashimoto等就針對乳酸對線粒體生物發生的影響進行深入研究，結果發現，高濃度乳酸可以增加PGC-1α mRNA表達，提高其下游NRF-2的DNA結合活性，從而導致COX的蛋白表達升高[49]。Arnold等研究發現，COXII表達減少還伴隨著mtDNA調控因子TFAM大量減少，以及與能量代謝和線粒體合成相關的轉錄調節因子PGC-1α的下調[50]。目前研究認為COXIV是線粒體生物發生的標志，其活性高低決定了線粒體生物發生水平[51]。2017年，Jeung等為研究乳酸菌對線粒體生物發生的影響，在分化過程中用曲線乳桿菌和植物乳桿菌共同處理前脂肪細胞，結果顯示，乳酸菌抑制了線粒體生物發生，線粒體質量下降，NRF-1雖未見明顯變化，但其他線粒體生物發生的主要調節因子，如PGC-1α和TFAM表達水平降低[52]。這可能是因為前脂肪細胞的諸多生理特性與骨骼肌細胞不同，從而導致乳酸菌對線粒體生物發生的影響不同。

4 線粒體生物發生影響肌纖維類型轉化

肌纖維是組成肌肉組織的基本單位，肌纖維的數目雖在出生時就已基本確定，但肌纖維是動態結構，易受到遺傳、營養和生理等諸多因素的影響，可以根據以下途徑從一種類型轉換為另一種類型：I?IIa?IIx?IIb[53]。肌纖維特性是影響肌肉質量和肉品質的重要因素。大量的研究已經表明，由于氧化型肌纖維主要進行氧化代謝，且肌紅蛋白含量和磷脂含量較高，糖原含量較低，肌纖維直徑較短，所以當肌肉中氧化型肌纖維比例高時，肉品的肌內脂肪含量、肉色、pH值較高，肌肉的保水性較好，肉質細嫩多汁，肉品風味更好[54]。因此通過各種途徑影響肌纖維轉化是當前改善肉品質的重要途徑。

研究表明，線粒體生物發生與肌纖維的氧化能力和肌纖維類型轉化密切相關。Chalkiadaki等研究發現，在骨骼肌中高水平表達SIRT1使線粒體生物發生增加，肌肉中快速收縮纖維向慢速收縮纖維轉變，且與肌肉萎縮相關的基因表達量降低[55]。鄒彬研究發現，電刺激干預能使線粒體生物發生降低，I型肌纖維數量減少，IIa、IIb和IIx型肌纖維數量增多[51]。此外，Zhang Yong等的研究表明，膳食補充丁酸鹽可以顯著增加mtDNA的數量，提高NRF-1、TFAM和細胞色素c的mRNA水平，提高線粒體生物發生，同時使I型肌纖維比例升高，IIb型肌纖維的比例降低；此外，隨著氧化型肌纖維比例的升高，肌肉的脂肪含量、嫩度和pH值等肉品質指標得到顯著改善[56]。可見，線粒體生物發生與肌纖維類型轉化和肉品質間必然存在某種聯系，而PGC-1α可能是連接兩者關系的樞紐。

首先，PGC-1α優先在富含I型肌纖維的骨骼肌中表達，且會使骨骼肌纖維向富含線粒體和高度氧化的I型肌纖維轉變[33]，其次，PGC-1α不僅是肌纖維類型轉化的關鍵調節劑，而且也是線粒體生物發生的主要調節因子。Zhang Lin等的一項體外研究證實，當骨骼肌中特異性過度表達PGC-1α后，小鼠和豬的線粒體功能增加，促進了慢速收縮纖維的形成[57]。Handschin等特異性敲除小鼠肌肉中PGC-1α后發現，小鼠的線粒體數量減少，且骨骼肌纖維從氧化型I型和IIa型轉向IIx型和IIb型，肌肉損傷程度增加[58]。以上研究結果說明，線粒體生物發生可以通過PGC-1α促進慢速收縮纖維的生成，其作用機制如下：CaN被認為是驅動快速收縮纖維轉變為慢速收縮纖維過程中重要的調節因子，而PGC-1α是Ca/CaN/CaMK信號傳導的下游靶點，CaMK在轉錄水平上誘導PGC-1α的表達，提高線粒體生物發生水平[33]。活化T細胞核因子（nuclear factor of activated T cells，Nfat）和Mef2是鈣調磷酸酶信號傳導在骨骼肌中表達的兩種已知效應物。此外，慢肌鈣蛋白I基因中的一個慢速收縮纖維特異性元件含有經典的Nfat位點，這對于慢速收縮纖維的表達是必需的[59]。PGC-1α直接與Mef2相互作用，Mef2在慢肌鈣蛋白I基因的慢速收縮纖維特異性元件中物理結合Nfat位點，增加I型肌纖維蛋白的表達[60]。

5 結 語

綜上所述，骨骼肌和線粒體生物發生關系密切，進一步明確線粒體生物發生與骨骼肌纖維的關系可為調控肌纖維進而改善肉品質提供新的思路。乳酸菌可以誘導線粒體生物發生增加，在這一過程中，骨骼肌細胞內激酶活化、活性氧的信號誘導作用以及PGC-1α信號轉錄可能是乳酸菌誘導線粒體生物發生的啟動因素。線粒體是細胞有氧代謝中心和能量合成的主要場所，其能量合成的調控因子較多，同時也是各種中間代謝產物的主要來源，這些都使得研究線粒體生物發生變得更加復雜。雖然目前關于乳酸菌與骨骼肌線粒體生物發生的研究仍存在較多空白，但不可否認的是，此研究將有助于人們更加充分地認識乳酸菌調控線粒體生物發生的分子機制，并為今后通過調控肌纖維類型轉化改善肉品質提供新途徑。