一氧化氮處理對馬鈴薯采后塊莖愈傷的促進及機制

韓占紅，王 斌，楊瑞瑞，楊 乾，李志程，Dov PRUSKY,2，畢 陽,*

（1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.以色列農業研究組織沃卡尼中心采后與食品研究所，以色列 貝達甘 50250）

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）是重要的糧菜兼用作物，在保障食物安全與營養方面作用突出。然而，馬鈴薯塊莖在采收以及采后分級、包裝、運輸和裝卸期間易受機械損傷[1]，表面形成的傷口不僅加速塊莖水分蒸騰，而且為多種采后病原菌的侵染提供了通道，導致塊莖貯藏期間的腐爛[2]。此外，真菌侵染還會在塊莖體內積累真菌毒素，造成潛在的食用安全隱患[3]。雖然馬鈴薯塊莖表面的傷口具有自我愈合的能力，但自然愈傷所需時間較長[4]。因此，亟待開發促進馬鈴薯塊莖采后愈傷的新措施。一些外源化學藥物可促進馬鈴薯的塊莖愈傷。脫落酸可通過促進馬鈴薯塊莖傷口處的苯丙烷代謝，提高抗氧化酶活性來加速塊莖的愈傷[5]。水楊酸及其結構類似物苯并噻重氮也可通過激活苯丙烷代謝而促進馬鈴薯塊莖的愈傷[6-7]。一氧化氮（nitric oxide，NO）是植物體內重要的信號分子，在調節植物應對外界生物和非生物脅迫的防御反應中發揮著積極的作用[8]。有研究表明，采用NO供體硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）處理番茄能提高番茄果實多種防御酶的活性，促進活性氧的積累，增強果實對Botrytis cinere和Rhizopus stolonifer的抗性[9-10]。NO可提高甘薯根苯丙烷代謝活性，增加傷口處木質化細胞層厚度，促進塊根的愈傷[11]。此外，NO還可通過誘導細胞壁胼胝質的沉積，提高損傷相關防御基因的轉錄水平來促進馬鈴薯葉片的愈傷[12]。雖然已有NO促進甘薯塊根和馬鈴薯葉片愈傷的報道，但NO是否影響馬鈴薯塊莖的采后愈傷尚鮮見報道。本研究以‘隴薯7號’馬鈴薯塊莖為試材，采用SNP溶液浸泡處理人工模擬損傷塊莖，于常溫黑暗條件下進行愈傷。評價處理對愈傷期間塊莖質量損失率及病情指數的影響，觀察塊莖傷口部位軟木脂和木質素的積累，分析傷口處組織苯丙烷代謝活性變化，以期為馬鈴薯塊莖的快速愈傷提供方法及理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

‘隴薯7號’馬鈴薯于2018年11月采自甘肅省渭源縣會川鎮，選取大小均勻、無病蟲害和機械傷的塊莖裝入網眼袋中（25 kg/袋），第二天運抵本實驗室，在（4±2）℃冷庫中貯藏待用。

硫色鐮刀菌（Fusarium sulphureum）由本實驗室保藏，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar medium，PDA）上保存待用。

SNP（純度98.5%）、聚乙二醇 天津市光復精細化工研究所；過氧化氫試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

7 4-S 不銹鋼雙面刀片 上海吉列有限公司；CX21FSIC光學顯微鏡、BX51熒光顯微鏡 日本奧林巴斯有限公司；UV-2450紫外-可見光分光光度計 日本島津公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；H-1850R高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；1510-04087酶標儀賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；DHP-9082恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；DW-HL218超低溫冰箱 中科美菱低溫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 塊莖人工損傷及SNP處理

塊莖人工損傷參照Jiang Hong等[7]的方法。將塊莖從冷庫中取出后回溫24 h。先用自來水沖洗塊莖除去表面泥土，然后用體積分數2% NaClO溶液浸泡3 min進行表面消毒，自然晾干后用刮皮刀在塊莖表皮中部刮出直徑為3 cm的傷口，每個塊莖刮傷口3 處。

塊莖的SNP浸泡處理參照Yin Jianyun等[11]的方法并略作修改。將上述損傷塊莖浸入0.5 mmol/L的SNP溶液中10 min，以清水浸泡作為對照，取出自然晾干后，裝入打孔的聚乙烯保鮮袋（30 cm×40 cm，厚度0.02 mm）中，置于常溫（20～25 ℃、相對濕度70%～80%）黑暗條件下進行愈傷，在愈傷的第3、5、7、14、21天進行愈傷效果評價的指標測定。

1.3.2 孢子懸浮液的制備及損傷接種

孢子懸浮液的制備參照Yin Yan等[13]的方法并略作修改。取28 ℃恒溫培養7 d的F. sulphureum一皿，加入5 mL無菌水，用滅菌涂布器輕輕刮下硫色鐮刀菌的孢子，經4 層紗布過濾至50 mL三角瓶中，漩渦振蕩15 s，使孢子分散均勻。使用血球計數板進行計數，將孢子濃度最終稀釋至1×106spores/mL。

損傷接種參照姜紅等[14]的方法，分別在塊莖愈傷第0、3、5、7、14、21天時，將40 μL上述孢子懸浮液用涂布器均勻涂于傷口表面，稍作晾干后裝入打孔的聚乙烯保鮮袋中（5 個塊莖/袋），于室溫（22±2）℃、相對濕度85%～90%的黑暗條件下貯藏7 d。

1.3.3 愈傷效果評價

1.3.3.1 質量損失率的測定

采用稱質量法測定質量損失率。每個處理用塊莖9 個，重復3 次。

1.3.3.2 病情指數的測定

發病級別分別定義為：0級，損傷表面不發??；1級，損傷表面0～25%發?。?級，損傷表面25%～50%發病；3級，損傷表面50%～75%發病；4級，損傷表面大于75%發病。每處理用塊莖20 個，重復3 次。病情指數按下式進行計算。

1.3.3.3 塊莖愈傷過程中軟木脂及木質素的沉積觀察

聚酚軟木脂（suberin polyphenolic，SPP）的沉積觀察參照Fugate等[15]的方法并稍作修改。用74-S不銹鋼雙面刀片垂直傷口表面切出厚度0.2～0.3 mm左右的薄片。按以下步驟完成切片染色：0.1%小檗堿染色45 min后，吸去染料，用蒸餾水和75%（體積分數，下同）乙醇溶液各沖洗3 遍，再用95%乙醇溶液沖洗2 遍，脫去染料，然后在0.25%甲苯胺藍中放置1～2 min進行復染，最后用蒸餾水和75%乙醇溶液洗去染料，SPP即染為紫藍色。將染色的切片置于載玻片上，蓋上蓋玻片并滴加蒸餾水在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

聚酯軟木脂（suberin polyaliphatic，SPA）的沉積觀察參照Lulai等[16]的方法并稍作修改。用不銹鋼雙面刀片垂直于塊莖愈傷表面切出0.2～0.3 mm厚的薄片，蒸餾水沖洗3 遍后，進行染色觀察。初染：質量分數0.05%甲苯胺藍染液染色45 min，染色過程中輕輕上下搖晃使其染色均勻；脫染料：分別用75%乙醇溶液沖洗3 次，再用蒸餾水沖洗3 次；復染：吸取1%中性紅染液，染色1.0～1.5 min；除去染料：先用蒸餾水沖洗，再用75%乙醇溶液沖洗，最后再用蒸餾水沖洗。將染好色的切片置于載玻片上，滴一滴蒸餾水后加蓋蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

木質素的染色觀察參照Alba等[17]的方法并略作修改。將損傷塊莖用不銹鋼雙面刀片垂直于傷口表面切出厚度為0.2～0.3 mm的薄片，用蒸餾水浸泡沖洗數遍，以除去切片組織中的淀粉顆粒，隨后置于干凈的載玻片上，滴加1 g/100 mL的間苯三酚染色1.5 min后，再加1～2 滴濃鹽酸，木質素即染為紅色，置于熒光顯微鏡下進行觀察并拍照。

塊莖愈傷組織中的SPP、SPA和木質素細胞層厚度參照van Oirschot等[18]的方法通過IS Capture圖像軟件進行測量并計算。

1.3.4 生化指標測定

參照Jiang Hong等[7]的方法。用不銹鋼刀片切取塊莖損傷部位及以下2～3 mm左右的愈傷組織，立即用液氮冷凍后用研樣機研磨成干粉裝入50 mL離心管中，于-80 ℃的超低溫冰箱中保存待測。

1.3.4.1 酶活力的測定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonia-lyase，PAL）活力的測定參照Koukol等[19]的方法并略作修改。取冷凍干粉1.0 g，加入3 mL提前預冷的提取緩沖液（含40 g/L聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）、2 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）和5 mmol/L β-巰基乙醇），于4 ℃、8 000×g條件下離心30 min，上清液即為粗酶提取液。反應體系：3 mL pH 8.8硼酸緩沖液（50 mmol/L）、0.5 mL L-苯丙氨酸（20 mmol/L）、0.5 mL粗酶提取液，測定反應體系混合10 s后在290 nm波長處的吸光度（A0），將混合液于37 ℃恒溫水浴鍋中反應1 h后，再次測定290 nm波長處的吸光度（A1）；空白對照以0.5 mL蒸餾水代替粗酶提取液，其余同反應體系。以每小時每克鮮質量果肉吸光度增加0.01為1 個PAL活力單位（U），PAL活力表示為U/g。

過氧化物酶（peroxidase，POD）活力的測定參照Jiang Aili等[20]的方法。取冷凍干粉2 g，加入5 mL乙酸-乙酸鈉提取緩沖液（pH 5.5，含1 mmol/L聚乙二醇、4 g/100 mL PVP和體積分數1% Triton X-100），于4 ℃、8 000 r/min條件下離心30 min，收集上清液即為粗酶提取液。反應體系：3.0 mL 25 mmol愈創木酚溶液、0.3 mL粗酶提取液，0.1 mL 0.5 mol/L H2O2溶液。反應15 s時測定混合液在470 nm波長處的吸光度，測定持續2 min，以蒸餾水作為參比。以每克鮮質量果肉每分鐘吸光度增加1為1 個POD活力單位（U），POD活力表示為U/g。

1.3.4.2 總酚、類黃酮和木質素的含量測定

總酚含量的測定參照Scalbert等[21]的方法。取冷凍干粉1.0 g，加入5 mL含體積分數0.5%乙酸和體積分數70%丙酮的混合溶液進行提取，之后將混合液置于4 ℃黑暗環境24 h，隨后8 000×g離心30 min，收集上清液用于總酚和類黃酮含量的測定。測定體系：1 mL提取液、稀釋10 倍的福林-酚試劑2 mL、2 mL 7.5 g/100 mL碳酸鈉溶液，50 ℃放置5 min，以甲醇作對照，在760 nm波長處測定OD值，并以沒食子酸為標準物質制定標準曲線來計算總酚含量，結果以每100 g鮮質量果肉中所含沒食子酸質量表示，單位為mg/100 g。

類黃酮含量的測定參照C e v k 等[22]的方法并略作修改。測定體系：0.5 m L 提取液、0.1 5 m L 10 g/100 mL AlCl3·6H2O溶液、0.15 mL 0.5 g/100 mL NaNO2溶液，常溫下靜置反應5 min后，加入1 mL 1 mol/L NaOH溶液，在510 nm波長處測定OD值，并以兒茶素為標準物質建立標準曲線計算類黃酮含量。結果以每100 g鮮質量果肉中所含的沒食子酸質量表示，單位為mg/100 g。

木質素含量的測定參照Hamerschmidt等[23]的方法。稱取冷凍干粉1.0 g，加入3 mL預冷的體積分數95%乙醇溶液，于4 ℃、8 000×g離心30 min，棄去上清液，將沉淀物用95%乙醇溶液洗滌3 遍，用乙醇與正己烷體積比為1∶2的溶液沖洗3 遍，將清洗后的沉淀物在烘箱中干燥24 h，然后溶于1 mL體積分數25%溴化乙酰冰醋酸溶液，在70 ℃下水浴30 min，隨后加入1 mL 2 mol/L NaOH溶液終止反應，再加入2 mL冰醋酸和0.1 mL 7.5 mol/L鹽酸羥胺，于4 ℃、8 000 r/min條件下離心30 min，取上清液0.5 mL并用冰醋酸定容至5 mL，于280 nm波長處測定OD值，木質素含量以每克鮮質量果肉的OD280nm表示。

1.3.4.3 H2O2含量的測定

H2O2含量使用過氧化氫試劑盒進行測定。稱取0.5 g的冷凍干粉，加入4.5 mL生理鹽水置于冰上進行勻漿，轉移至10 mL離心管中，于4 ℃、8 000×g離心10 min，取上清液。按試劑盒說明書加入相應試劑，混勻后，于405 nm波長處測定OD值。H2O2含量單位為mmol/g，結果以蛋白質量計。參照Brabford[24]的考馬斯亮藍染色法，以牛血清白蛋白為標準蛋白作標準曲線，計算蛋白含量。

1.4 數據統計與分析

上述各項測定至少重復3 次。全部數據采用Microsoft Excel 2010軟件計算平均值及標準偏差，采用Origin 8.0軟件作圖；用SPSS 21.0軟件進行Duncan’s差異顯著性分析，P＜0.05表示有統計學顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 NO處理對愈傷期間塊莖質量損失率和病情指數的影響

由圖1A可見，隨著愈傷時間延長，SNP處理組塊莖與對照組塊莖的質量損失率均逐漸上升，且SNP處理組塊莖的質量損失率顯著低于對照組，愈傷7 d時，SNP處理組塊莖質量損失率較對照組低43.5%（P＜0.05）。由圖1B可見，隨著愈傷時間延長，SNP處理組與對照組損傷接種塊莖的病情指數逐漸降低，且SNP處理組塊莖的病情指數低于對照組，在愈傷7 d時，SNP處理組塊莖病情指數低于對照組27%（P＜0.05）。質量損失率和病情指數的結果表明，NO處理促進了馬鈴薯塊莖的愈傷。

圖1 NO處理對馬鈴薯塊莖愈傷期間質量損失率（A）和病情指數（B）的影響Fig. 1 Effect of NO treatment on mass loss rate (A) and disease index (B)of potato tubers during wound healing

2.2 NO處理對馬鈴薯塊莖傷口處軟木脂和木質素積累的影響

圖2 NO處理對愈傷期間馬鈴薯塊莖傷口處SPP（A）、SPA（B）和木質素（C）積累的影響Fig. 2 Effect of NO treatment on the accumulation of SPP (A), SPA (B)and lignin (C) in wounds of potato tubers during healing

圖3 NO處理對愈傷期間馬鈴薯塊莖傷口處SPP（A）、SPA（B）和木質素（C）細胞層厚度的影響Fig. 3 Effect of NO treatment on cell layers thickness of SPP (A),SPA (B) and lignin (C) in wounds of potato tubers during healing

愈傷期間，SNP處理組塊莖和對照組塊莖傷口處的SPP和SPA均逐漸積累，積累差異始于愈傷的第3天，其積累速率和積累量均明顯高于對照組（圖2A、B）。同樣，SPP和SPA細胞層厚度在愈傷期間逐漸增加，且SNP處理組顯著高于對照組。愈傷7 d時，SPP和SPA細胞層厚度分別高于對照組25.2%和27.3%（P＜0.05）（圖3A、B）。愈傷期間，木質素的積累速率和積累量也逐漸增加，差異始于第5天，SNP處理組的積累速率和積累量均明顯高于對照組（圖2C）。處理組塊莖傷口處木質素細胞層的厚度在愈傷期間也顯著高于對照組，愈傷7 d時高出對照組23.6%（P＜0.05）（圖3C）。上述結果表明，NO處理促進了馬鈴薯塊莖傷口處軟木脂和木質素的積累。

2.3 NO處理對馬鈴薯塊莖愈傷組織中PAL活力以及總酚、類黃酮和木質素含量的影響

圖4 NO處理對愈傷期間馬鈴薯塊莖傷口處PAL活力（A）以及總酚（B）、類黃酮（C）和木質素（D）含量的影響Fig. 4 Effect of NO treatment on PAL activity (A), and the contents of total phenols (B), flavonoids (C) and lignin (D) in wounds of potato tubers during healing

隨愈傷時間延長，SNP處理組和對照組塊莖傷口處的PAL活力先升高后下降，愈傷時間為7 d時達到峰值，SNP處理組塊莖的PAL活力始終高于對照組，愈傷14 d時高出對照組75.3%（P＜0.05）（圖4A）。隨愈傷時間延長，SNP處理組與對照組塊莖傷口處的總酚和類黃酮的含量整體呈持續增加趨勢，除愈傷第3天外，其他愈傷時間的SNP處理組均顯著高于對照組。愈傷14 d時，SNP處理組塊莖的總酚和類黃酮含量分別高出對照31%和39.6%（P＜0.05）（圖4B、C）。隨愈傷時間延長，SNP處理組與對照組塊莖傷口處的木質素含量不斷增加，SNP處理組的木質素含量均顯著高于對照組，愈傷14 d時高出對照組32.8%（P＜0.05）（圖4D）。上述結果表明，NO處理激活了馬鈴薯塊莖傷口處組織的苯丙烷代謝。

2.4 NO處理對馬鈴薯塊莖愈傷組織中的H2O2含量和POD活力的影響

SNP處理組和對照組塊莖傷口處的H2O2含量隨愈傷時間的延長而逐漸升高，愈傷時間較短（0～5 d）時，對照組的H2O2含量高于SNP處理組，愈傷時間較長（7～21 d）時，SNP處理組的H2O2含量高于對照組，愈傷14 d時高出對照組34.6%（P＜0.05）（圖5A）。SNP處理組和對照組塊莖傷口處的POD活力隨愈傷時間延長不斷增加，且SNP處理組塊莖的POD活力始終高于對照組，愈傷14 d時高出對照組81.7%（P＜0.05）（圖5B）。

圖5 NO處理對愈傷期間馬鈴薯塊莖傷口處H2O2含量（A）和POD活力（B）的影響Fig. 5 Effect of NO treatment on H2O2 content (A) and peroxidase activity (B)in wounds of potato tubers during healing

3 討 論

作為植物體內重要的信號分子，NO在誘導植物抗病防御反應中發揮著重要作用[25]，其可與水楊酸、茉莉酸（jasmonic acid，SA）、乙烯、活性氧以及Ca2+通道等信號分子相互作用，協同調控植物的抗病防御反應[26-27]。此外，NO還可激發苯丙烷代謝，從而誘導木質素以及一系列植保素的合成[28]。本研究發現，NO可激活馬鈴薯塊莖傷口處的苯丙烷代謝，提高POD活力和愈傷后期H2O2含量，促進傷口處軟木脂和木質素的積累，加速馬鈴薯塊莖的采后愈傷。由此表明，NO在促進馬鈴薯塊莖的愈傷中發揮了積極作用。

苯丙烷代謝在馬鈴薯塊莖愈傷中具有重要的貢獻，可為SPP和木質素提供聚合所需的酚類物質單體[29]。PAL是苯丙烷代謝的關鍵酶和限速酶，也是參與苯丙烷代謝第一步反應的酶[30]，可催化L-苯丙氨酸脫去氨基生成反式肉桂酸，反式肉桂酸在肉桂酸-4-羥化酶的作用下生成香豆酸、阿魏酸和咖啡酸等酚酸，這些酚酸會被4-香豆酰-輔酶A（coenzyme A，CoA）-連接酶轉化成為相對應的香豆酸-CoA、阿魏酸-CoA和咖啡酸-CoA，反應生成的這些酚酸-CoA會在肉桂酰CoA還原酶和肉桂醇脫氫酶的催化下合成SPP所需的酚類物質單體[31]。此外，肉桂醇脫氫酶還會將肉桂醛、咖啡醛和芥子醛轉化為p-肉桂醇、咖啡醇和芥子醇，作為合成木質素的單體[32]。這些木質素單體在POD的作用下聚合形成木質素[33]?？偡印㈩慄S酮和木質素是苯丙烷代謝的重要終產物。酚類化合物一方面作為合成木質素的前體，參與了愈傷結構的形成與傷口的修復；另一方面其本身具有抗病原菌的特性，可以抵抗真菌孢子的產生、萌發及其菌絲生長[34]。類黃酮具有較強的抗氧化和自由基清除能力，可有效抑制多種真菌孢子的萌發和菌絲生長[35]。木質素不僅作為植物體內的結構性屏障抵抗病原物侵染，還可使真菌菌絲尖端木質化[36]。已有研究表明，NO可有效誘導MdDHQS、MdSKDH、MdSK和MdEPSPS基因的表達，促進莽草酸途徑中莽草酸、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的積累，從而為苯丙烷代謝途徑提供底物[37]。NO還可顯著誘導煙草和擬南芥葉片中SA的積累[38-39]。此外，NO處理還可顯著上調馬鈴薯葉片損傷相關基因PAL的轉錄水平[12]。由此表明，NO通過促進SA積累激發了苯丙烷代謝。本研究發現，NO處理提高了馬鈴薯塊莖傷口處的PAL活力，促進了總酚、類黃酮和木質素的積累。該結果與Yin Jianyun[11]等采用NO處理甘薯根和Ge Yonghong等[36]采用NO處理蘋果果實觀察到的結果類似。

H2O2在馬鈴薯塊莖愈傷組織的形成中具有信號分子和氧化交聯的雙重作用。H2O2既可作為信號分子激發愈傷早期的防衛反應[40]，如作為激活苯丙烷代謝的第二信使[41]，也可上調軟木脂形成過程中的相關基因表達和蛋白合成，參與酚單體與芳香結構域的氧化交聯[42-43]。愈傷過程中所需的活性氧主要來源于質膜NADPH氧化酶[44]。首先，NADPH氧化酶通過轉移NADPH電子到O2產生O2-·，由于O2-·存活壽命很短，其很快在超氧化物歧化酶的作用下歧化生成壽命較長的H2O2[45]。有研究表明，NO可提高超氧化物歧化酶活力來增加番茄[10]和藍莓[45]果實的H2O2水平。由此表明，NO在誘導H2O2的積累方面具有積極貢獻。POD作為軟木脂和木質素合成的關鍵酶，在H2O2參與下通過氧化交聯參與了軟木脂和木質素的聚合[46]。SPP主要由苯丙烷代謝產生的羥基肉桂酸及其衍生物阿魏酸等通過酯鍵和醚鍵連接形成[47]，主要阻止細菌對損傷塊莖的侵染。SPA主要由α,ω-二元酸、ω-羥基酸、長鏈脂肪酸、中長鏈脂肪酸以及小部分的烷烴和烷酸通過酯鍵相連聚合而成，這些單體主要通過脂肪酸代謝產生[48]，SPA主要對真菌性病害有抵抗作用。最終，SPP和SPA會進一步在甘油的交聯作用下聚合形成三維網狀結構，沉積于細胞壁表面形成封閉層[49]。本研究發現，NO處理后的塊莖具有較高的POD活力和在愈傷后期具有較高的H2O2含量，表明POD和H2O2積極參與了軟木脂和木質素底物的氧化交聯。但至于POD如何氧化交聯軟木脂和木質素單體尚有待進一步的探討研究。

4 結 論

與對照組相比，NO處理可激活馬鈴薯塊莖傷口處的PAL活力，提高了總酚、類黃酮和木質素的含量，NO處理還可增加POD活力和愈傷后期的H2O2含量，加速軟木脂和木質素在傷口處的積累，從而降低了損傷塊莖的質量損失率和病情指數，促進了馬鈴薯塊莖的采后愈傷。