優勢霉菌對稻谷品質的影響

劉 慧，周建新，方 勇，邱偉芬

（南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇 南京 210023）

稻谷是我國主要的糧食作物，占全國糧食總量的40%[1]。儲藏階段的稻谷可能遭受各種微生物的污染，從而影響儲藏安全和食用品質，有些微生物在適宜條件下還會分泌毒素，對人類健康和生命造成嚴重威脅[2]。霉菌由于其生長對所需水分與溫度等條件的要求遠比細菌、放線菌和酵母菌低，成為對稻谷危害最大的微生物，加之我國稻谷儲藏期長及儲藏條件不夠完善，霉菌活動對稻谷品質造成嚴重影響[3-4]。目前已有不少學者對稻谷中霉菌的種類及霉菌對稻谷品質的影響進行了研究[5-7]，但是不同霉菌菌株對稻谷品質影響差異的研究尚少。因此，本研究擬通過將分離自稻谷的不同霉菌菌株接種于無菌稻谷上，分析稻谷的霉菌生長情況、品質指標及相關酶活力變化，探究不同霉菌菌株對稻谷品質的影響，以確定對稻谷品質影響較大的菌株從而進行重點防控。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秈稻（2017年收獲）采樣于湖南省衡陽市角山米業有限責任公司。按照GB/T 5491—1985《糧食、油料檢驗扦樣、分樣法》，采用3 層、5 點取樣法，分別以糧倉東南角、東北角、西南角、西北角以及中央點作為取樣點，每個取樣點分別在距糧堆表層0.5 m、中央層、距地面0.5 m取樣，樣品放置在無菌采樣袋中，于4 ℃保存。實驗前將15 個點的樣品等量混合。

高鹽察氏培養基、察氏培養基 北京陸橋技術責任有限公司；淀粉酶測試盒、多酚氧化酶測試盒、過氧化物酶測試盒、植物丙二醛測試盒、過氧化氫酶測試盒南京建成生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1F型潔凈工作臺 江蘇蘇凈集團安泰公司；LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療機械廠；GNP-9160型隔水式恒溫培養箱 上海三發科學儀器有限公司；CM-5色差儀 日本柯尼卡美能達公司；JH-722s可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；HH-6恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；101-3AS電熱鼓風干燥箱 上海蘇進儀器設備廠；ELX800酶標儀美國Bio-Tek公司。

1.3 方法

1.3.1 稻谷樣品中霉菌的分離純化與鑒定

稻谷樣品中霉菌的分離純化參照GB 4789.15—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》，選用高鹽察氏培養基，加入稻谷樣品稀釋液，在28 ℃下培養7 d，將獲得的菌株通過劃線分離培養法、三點法進行分離純化培養，得到純化菌株。將純化菌株進行顯微觀察，拍攝其菌落、菌絲及孢子照片，對菌株進行初步判斷。同時對得到的純化菌株提取DNA[8],以引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC對其進行擴增，測序結果在GenBank數據庫中進行BLAST對比。將鑒定過的菌株斜面培養，用液體石蠟隔絕空氣[9]后，于4 ℃保存。

1.3.2 稻谷輻照滅菌

參照沈飛等[10]的方法，將稻谷樣品經南京航空航天大學輻照中心60Co輻照（12 kGy）滅菌后裝入無菌塑料密封袋，4 ℃冷藏備用。

1.3.3 霉菌孢子懸浮液制備

參照張繼忠等[11]的方法，將蠟封保藏的菌株接種至新的斜面培養基，置于28 ℃培養箱內培養，待霉菌生長產生大量孢子，用無菌水沖洗培養基表面，收集孢子懸浮液，置于三角瓶中振蕩10 min，再用無菌脫脂過濾除去營養菌體。將得到的孢子懸浮液，按照GB/T 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》統計不同霉菌孢子懸浮液濃度，并用無菌水調節懸浮液濃度至約1×108CFU/mL[12]，4 ℃冷藏備用。

1.3.4 稻谷樣品霉菌接種

無菌環境下，稱取每份約10 g的滅菌稻谷樣品，置于無菌培養皿中，用移液槍精確移取0.1 mL霉菌孢子懸浮液均勻接種于樣品上，充分漩渦使其均勻分布。接種完畢后，參照楊基漢[13]、付消費[14]等的方法，并結合采樣糧庫的實際儲藏環境，將處理過的樣品置于30 ℃、相對濕度85%環境中進行儲藏。分別在第2、4、6、8、10天取樣檢測。

1.3.5 霉菌菌落直徑的測定

參照文獻[15]燕麥培養基的制備方法，將稻谷磨粉后過篩，取稻谷粉60 g，溶于600 mL蒸餾水中，制成勻漿，加熱至45～50 ℃。再取瓊脂12.5 g，溶于400 mL水中，與稻谷粉勻漿混合后，121 ℃滅菌90 min。滅菌結束將稻谷培養基倒入培養皿，待其凝固后，用移液槍準確移取10 μL霉菌懸浮液于平板中央，置于28 ℃培養箱中，48 h后開始測量菌落直徑，測量間隔為12 h。測定兩條垂直的菌落直徑，以這兩垂直直徑的平均值作為菌落直徑[15]。

1.3.6 稻谷霉菌計數

參照GB 4789.15—2016，選用高鹽察氏培養基，28 ℃培養7 d后對稻谷霉菌進行計數。

1.3.7 色度的測定

使用CM-5色差儀對霉菌菌落進行色度測定，為減小誤差帶來的影響，每組樣品進行3 次重復測定，取平均值進行數據分析。

1.3.8 稻谷脂肪酸值測定

稻谷脂肪酸值測定參照GB/T 15684—2015《谷物碾磨制品 脂肪酸值的測定》。

1.3.9 稻谷丙二醛含量和淀粉酶、多酚氧化酶、過氧化物酶活力測定

利用相應試劑盒測定稻谷樣品的丙二醛含量和淀粉酶、多酚氧化酶、過氧化物活力，其中酶活力結果以蛋白質量計。

1.4 數據處理與分析

每組實驗均設3 組平行，采用JMP 10軟件進行數據分析和t檢驗，采用Origin 2017軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 稻谷樣品中霉菌的形態學與基因鑒定結果

形態學主要觀察菌落的形態、顏色、質地等，使用光學顯微鏡、電子顯微鏡觀察菌絲與孢子的形態[16]。將分離純化的霉菌菌屬進行形態學觀察，同時進行基因測序，結果如表1所示[17-18]。經過霉菌形態學對比和測序，確定稻谷樣品中的主要霉菌屬有黃曲霉（Aspergillus flavus）、黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、土曲霉（Aspergillus terreus）、桔青霉（Penicillium citrinum）、產黃青霉（Penicillium chrysogenum）和島青霉（Penicilliumsp. MF555）。實驗結果與其他研究人員對稻谷霉菌區系調查結果[19-22]一致，即稻谷在儲藏過程中，優勢霉菌為黃曲霉、黑曲霉等曲霉屬和產黃青霉、桔青霉等青霉屬。

2.2 稻谷霉菌菌落直徑與接種稻谷霉菌計數結果

表1 稻谷中主要可培養霉菌菌屬鑒定結果Table 1 Identification of main cultivable fungi isolated from rice

圖1 不同霉菌菌株在稻谷培養基中的生長情況Fig. 1 Growth of different mold strains in rice medium

稻谷樣品中不同霉菌在稻谷培養基上的生長趨勢和菌落直徑變化分別如圖1A、B所示。由圖1可以看出，不同霉菌菌株在稻谷培養基中快速增長，表明稻谷是曲霉屬和青霉屬良好的生長基質。不同霉菌菌落的增長速率與菌落直徑之間存在差異，以黑曲霉菌落直徑增長最快，菌落直徑最大，其次是黃曲霉、米曲霉、土曲霉，青霉屬菌落直徑增長速率相對于曲霉屬較為緩慢，以島青霉最為遲緩，表明曲霉屬在稻谷中的污染范圍較青霉屬更快更大。

圖2 接種不同菌株的稻谷霉菌數量變化Fig. 2 Changes in number of different inoculated mold strains on rice

稻谷霉菌量與是否發生霉變及霉變的程度有關，霉菌量在3.0（lg（CFU/g））以下時，稻谷處于未霉變狀態,在3.0～7.0（lg（CFU/g））時處于霉變狀態，超過7.0（lg（CFU/g））時霉變已經相當嚴重[23]。實驗選取霉變狀態稻谷以探究不同霉菌對稻谷品質與相關酶活力的影響。如圖2所示，對接種不同霉菌孢子懸浮液2 d后的稻谷樣品進行計數，發現霉菌菌落總數均在6.012～6.350（lg（CFU/g））之間，說明接種成功。不同菌株接種于稻谷樣品后，霉菌便開始快速增殖，樣品霉變程度逐漸加深。不同霉菌菌株的增長速率之間存在差異，以黃曲霉和黑曲霉繁殖速率最快，儲藏10 d后菌落總數分別增加了2.029、1.960（lg（CFU/g）），其次是米曲霉和島青霉，繁殖速率較慢的是桔青霉和產黃青霉，儲藏10 d后菌落總數分別增加了0.620（lg（CFU/g））和0.770（lg（CFU/g））。

2.3 接種稻谷樣品主要品質變化

2.3.1 色度的變化

圖3 接種不同菌株的稻谷外觀和色度變化Fig. 3 Changes in appearance and color parameters of rice inoculated with different strains

L*值代表明度，ΔL*為正表示偏白，為負表示偏暗；b*值代表褐變程度，Δb*為正表示黃色，為負表示藍色[24.25]。由圖3可知，隨著儲藏時間的延長，稻谷顏色逐漸加深，至儲藏第4天，霉菌菌落開始覆蓋稻谷表面，儲藏至第10天時，黃曲霉、黑曲霉、米曲霉幾乎將稻谷表面全部覆蓋，土曲霉和青霉屬菌株菌落覆蓋稻谷表面面積較小，這與不同菌株菌落直徑的測定結果相對應。隨儲藏時間延長，稻谷L*值呈現先上升后下降的趨勢，這是因為曲霉屬和青霉屬菌株在生長初期會先長出白色菌絲，導致稻谷表面明度上升[26]。儲藏末期，接種黑曲霉的稻谷表面L*值下降至66.33，在接種稻谷中亮度最低，其次是黃曲霉和米曲霉，分別為71.64和72.28，土曲霉和青霉屬菌株由于自身顏色和菌落生長較慢，對稻谷表面明度影響較小。除接種黑曲霉的稻谷外，接種其他霉菌的稻谷b*值呈現持續上升趨勢，說明稻谷表面顏色逐漸向黃褐色轉變，至儲藏末期，接種黃曲霉的稻谷表面褐變最嚴重，b*值達到了21.39，其次是米曲霉，達到了17.01，接種土曲霉和青霉屬菌株的稻谷表面褐變程度相近，b*值在16.23左右。

2.3.2 脂肪酸值的變化

圖4 接種不同菌株的稻谷脂肪酸值變化Fig. 4 Changes in fatty acid value of rice inoculated with different strains

稻谷中的脂類通過氧化降解為游離脂肪酸，一般來說脂肪酸值越高，稻谷品質越差[27]。由圖4可知，隨著儲藏時間的延長，接種菌株后的稻谷脂肪酸值呈先上升后下降的趨勢。在儲藏第6天，脂肪酸值達到最高，其中接種黑曲霉的稻谷脂肪酸值最高，達到了346.78 mg/100 g，其次是接種黃曲霉的稻谷（252.7 mg/100 g），接種土曲霉、米曲霉和青霉的稻谷脂肪酸值為100 mg/100 g。出現這種現象可能是前期脂類物質大量水解成游離脂肪酸，后期脂肪酸氧化成酮、醛等物質的速度加快，導致脂肪酸值降低[28]。在整個儲藏過程中，接種黑曲霉的稻谷脂肪酸值上升最快，其次是黃曲霉，接種桔青霉的稻谷脂肪酸值略高于米曲霉，脂肪酸值變化最小的是接種土曲霉的稻谷。在儲藏末期，脂肪酸值最高的是接種黑曲霉的稻谷，為148.93 mg/100 g，其次是接種黃曲霉的稻谷，為118.48 mg/100 g，接種米曲霉、桔青霉、土曲霉、產黃青霉和島青霉的稻谷脂肪酸值均下降至100 mg/100 g以下。

2.3.3 丙二醛含量的變化

如圖5所示，隨著儲藏時間的延長，稻谷丙二醛含量持續增加，儲藏前期稻谷丙二醛含量增加較慢，儲藏8 d后，丙二醛含量快速增加，增加趨勢呈現“前慢后快”的特點，一方面可能是因為儲藏后期細胞氧化損傷不斷積累，膜脂過氧化程度嚴重，細胞逐漸裂解[29]；另一方面，經過儲藏前期的積累，稻谷中存在大量脂肪酸，氧化后導致丙二醛含量快速增加[30]。儲藏末期，接種黑曲霉的稻谷丙二醛含量最高，為108.82 nmol/g，其次是接種黃曲霉的稻谷，丙二醛含量為96.47 nmol/g，接下來依次是接種島青霉、桔青霉、產黃青霉、米曲霉和土曲霉的稻谷。

圖5 接種不同菌株的稻谷丙二醛含量變化Fig. 5 Changes of malondialdehyde content in rice inoculated with different strains

2.4 接種稻谷樣品酶活力變化

圖6 接種不同菌株的稻谷淀粉酶活力變化Fig. 6 Changes in amylase activity in rice inoculated with different strains

2.4.1 淀粉酶活力的變化

淀粉酶活力影響稻谷的食用品質，其降低會導致淀粉黏度下降[31]。由圖6可知，隨著儲藏時間的延長，淀粉酶活力不斷下降，這可能是因為生物體受到生物或非生物脅迫時，細胞內自由基的產生與清除動態平衡被破壞，過多的自由基會攻擊細胞蛋白、DNA和膜結構，使得淀粉酶活力降低[32]。至儲藏末期，接種島青霉的稻谷淀粉酶活力最低，為0.000 7 U/mg，其次是接種土曲霉的稻谷（0.004 9 U/mg），接下來依次是接種產黃青霉、黑曲霉、桔青霉、米曲霉、黃曲霉的稻谷。

圖7 接種不同菌株的稻谷多酚氧化酶活力變化Fig. 7 Changes in polyphenol oxidase activity in rice inoculated with different strains

2.4.2 多酚氧化酶活力的變化

多酚氧化酶會引起稻谷發生酶促褐變，催化內源性多酚物質氧化成黑色素，導致稻谷表面顏色不斷加深[33-34]。由圖7可知，隨儲藏時間延長，各組稻谷多酚氧化酶活力呈現先上升后下降的趨勢，這與自由基積累有關。儲藏末期，接種黃曲霉的稻谷多酚氧化酶活力最低（2.444 U/mg），其次是接種米曲霉的稻谷（4.000 U/mg），接下來依次是接種黑曲霉、土曲霉、島青霉、產黃青霉和桔青霉的稻谷。

2.4.3 過氧化氫酶活力的變化

圖8 接種不同菌株的稻谷過氧化氫酶活力變化Fig. 8 Changes in catalase activity in rice inoculated with different strains

過氧化氫酶是生命體內酶類抗氧化系統的主要物質，可以催化H2O2生成水和氧氣[35-36]。由圖8可知，稻谷接種霉菌菌株后，細胞內產生的自由基不能被及時清除，導致細胞蛋白、DNA和膜結構被攻擊，使得過氧化氫酶活力不斷下降。在儲藏末期，接種黃曲霉的稻谷過氧化氫酶活力最低（0.014 U/mg），其次是接種黑曲霉的稻谷（0.181 U/mg），接下來依次是接種產黃青霉、桔青霉、島青霉、米曲霉和土曲霉的稻谷。

3 結 論

經傳統培養和基因鑒定，發現湖南稻谷中主要的可培養霉菌菌種為黃曲霉（Aspergillus flavus）、黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、土曲霉（Aspergillus terreus）、桔青霉（Penicillium citrinum）、產黃青霉（Penicillium chrysogenum）和島青霉（Penicilliumsp. MF555）。在這7 種菌株中，黃曲霉與黑曲霉對稻谷產生相對更大的劣變影響，其中接種這兩種菌的稻谷儲藏10 d后菌落總數分別增加了2.029、1.960（lg（CFU/g）），且幾乎將稻谷表面全部覆蓋，而儲藏末期，接種黃曲霉的稻谷褐變最為嚴重。在儲藏末期，脂肪酸值最高的是接種黑曲霉的稻谷（148.93 mg/100 g），其次是接種黃曲霉的稻谷（118.48 mg/100 g），接種黑曲霉的稻谷丙二醛含量最高（108.82 nmol/g），其次是接種黃曲霉的稻谷（96.47 nmol/g）。至儲藏末期，島青霉對稻谷淀粉酶活力影響最大，第10天時只有0.000 7 U/mg。而對多酚氧化酶影響最大的是黃曲霉，儲藏到第10天僅為2.444 U/mg。在儲藏末期，對稻谷過氧化氫酶影響最大的也是黃曲霉和黑曲霉，儲藏10 d時酶活力分別為0.014 U/mg和0.181 U/mg。根據前研究結果表明，黃曲霉和黑曲霉是稻谷儲藏過程中的優勢菌株，且本實驗證明了這兩種菌株對稻谷品質影響較大，因此在未來有關儲糧安全的研究中，應該更加關注對于曲霉屬，特別是對黃曲霉和黑曲霉的防控。本實驗僅研究了單個菌株在嚴重霉變情況下對稻谷品質的影響，后續實驗將會以此為基礎，繼續探究不同污染程度的多種優勢霉菌對稻谷品質的影響及防控優勢霉菌對于稻谷儲藏安全的意義，以便更加明確優勢霉菌對稻谷的影響。