基于低場核磁共振技術研究新微凍氣調羅非魚片水分遷移與品質變化的相關性

汪春玲，付仁豪，裴志勝，林向東，謝起斌，馮愛國,3,*

（1.海南大學食品科學與工程學院，海南 海口 570228；2.海南勤富食品有限公司，海南 海口 517300；3.海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心，海南 海口 570228）

羅非魚（Oreochromis niloticus）又名非洲鯽魚，具有生長速度快、繁殖能力強、食性雜、抗病力強等特點，是聯合國糧農組織推薦的重要水產養殖品種之一。我國現已成為世界上最大的羅非魚養殖國和供應國，據統計，2018年我國水產品總產量6 457.66萬 t，其中羅非魚產量約為162.45萬 t，占世界總產量的41%左右，羅非魚已成為我國經濟魚類之一[1-3]。

水產品在貯藏過程中的品質受多種因素影響，更易受水分含量及遷移變化的影響[4]。近年來，低場核磁共振（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）及其成像（magnetic resonance imaging，MRI）技術多應用于食品，其能直觀地反映食品中各狀態的水分含量及變化，因食品的一些特性與水分有著密切關系，可結合品質指標對其進行相關性分析，間接反映食品品質[5-6]。有相關研究表明，利用LF-NMR技術可對產品進行品質表征。其中，張珂等[7]利用LF-NMR研究海藻糖對凍藏羅非魚片的品質影響，發現魚肉的橫向弛豫時間T2與其持水性、Ca2+-ATPase活性和彈性等呈正相關。Tan Mingqian等[8]利用NMR技術對多次凍融的速食海參的水分進行研究，結果顯示T22、A22、A23與融冰損失、持水性、硬度等指標均具有良好的相關性。因此，LF-NMR作為一種無損快速檢測技術，結合理化指標檢測對水產品進行品質監測是行之有效的方法。

由于凍羅非魚片的標準出口凍品溫度要求不高于-18 ℃，以保證魚肉在貯藏期內的品質鮮度，但冷凍耗能巨大，對設備要求高，造成出口成本偏高。因此，本實驗以延伸傳統微凍（-4 ℃）[9]結合氣調保鮮技術來達到接近冷凍（-18 ℃）魚片的品質效果，通過LF-NMR技術監測羅非魚片內部的水分變化，以探究不同低溫貯藏下氣調羅非魚片的水分遷移變化及其品質的相關性，從而篩選出合適的部分冷凍溫度條件，以期為工廠冷凍溫度條件多元化及羅非魚片貯藏提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚片購自海口某羅非魚加工廠。

聚丙烯（polypropylene，PP）封口膜（厚度55 μm）無錫歐亞特包裝材料有限公司；H S-7 P P 托盤（21 cm×13.3 cm×3.5 cm） 上海耶倫材料公司；填充氣體（CO2、O2、N2） 海口金厚特種氣體有限公司；硼酸 廣州化學試劑廠；鹽酸、三氯乙酸（純度≥99.0） 西隴科學試劑公司；氯化鈉 廣州市金華大化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

NMI20-040H-I LF-NMR成像分析儀 上海紐曼公司；CR-10型色差儀 日本柯尼卡美能達公司；Oxybaby M+I O2/CO2氣體檢測分析儀 德國威特公司；MAP-H360復合氣調包裝保鮮機 蘇州森瑞保鮮設備有限公司；101-3SB電熱恒溫干燥箱 紹興市上虞區滬越儀器設備廠；FA2004B型分析天平 上海佑科儀器儀表有限公司；BCD-356WJ型電冰箱 青島海爾股份有限公司；HJ-4四聯磁力加熱攪拌器 金壇市環宇科學儀器廠；pHS-3C型pH計 上海偉業儀器廠；JJ-2型高速組織搗碎機 上海標本模型廠；K9840凱氏定氮儀 濟南海能儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 魚片預處理

選購130 g左右的魚片，加碎冰后裝入泡沫箱迅速運回實驗室，將魚片速凍至中心溫度分別為-4、-8、-12、-18 ℃，然后進行氣調包裝（1 片/盒），每組15 盒，充氣比例為V（CO2）∶V（O2）∶V（N2）＝6∶1∶3（經實驗室前期預實驗得出該比例保鮮效果更好）。將樣品放入相應的中心溫度貯藏，每盒裝1 片，每7 d靜水解凍后進行測定。

1.3.2 LF-NMR測定T2及成像

將貯藏結束后的氣調魚片置于靜水（25 ℃）中解凍30 min至魚片柔軟且表面無冰珠，切取大小為3 cm×2 cm×2 cm的背部魚肉，用聚乙烯保鮮膜包住魚肉塊，利用LF-NMR進行T2的測定，再進行成像分析。選取數據量200、弛豫時間點數400、反演方式SIRT、迭代次數10 000 000的參數對數據進行批量反演。

LF-NMR分析的條件：共振頻率20 MHz、磁體強度0.52 T、線圈直徑40 mm、磁體溫度32 ℃。弛豫參數設置：選擇CPMG序列，采樣頻率SW為200 kHz，模擬增益RG1為1，P1為9.00 μs，P2為18.00 μs，數字增益DRG1為3，TD為200 054，PRG為2，重復采樣間隔時間TW為5 000 ms，累加采集次數NS為4，回波時間TE為0.50 ms，回波個數NECH為3 000。

利用NMR成像軟件進行成像，成像參數：重復等待時間TR為500 ms，回波時間TE為18.125 ms，選擇俯視圖和縱切4 個層面進行保存圖像，按1-PRESCAN、2-SCOUT、3-SCAN順序完成成像。圖像處理：質子密度圖用NMR圖像軟件對其進行統一映射、濾波、偽彩，以Hotmetal類型的BMP格式進行保存。

1.3.3 汁液流失率測定

氣調包裝前稱魚片質量（m0/g），測定時擦去解凍后的魚片表面的水分，稱量并記錄質量（mt/g）。汁液流失率按公式（1）計算[10]。

1.3.4 色差測定

色差的測定參考Gai Shengmei等[11]的方法，并稍作修改。選定魚片中心靠下部位，使用色差儀測量L、a、b值。L值表示亮度，a、b值分別表示紅綠度和黃藍度，+a表示偏紅色，-a表示偏綠色，+b表示偏黃色，-b表示偏藍色。色差ΔE為顏色的變化程度，按公式（2）計算。

式中：L0、a0、b0表示魚片貯藏第0天的色澤；Lt、at、bt表示貯藏第t天的色澤。

1.3.5 pH值測定

pH值的測定參考張強等[12]的方法，并稍作改動。稱取10 g攪碎的魚肉并加入100 mL純水，磁力攪拌30 min，靜置20 min，取30 mL濾液采用pH計進行測定。

1.3.6 菌落總數測定

菌落總數的測定參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[13]。

1.3.7 揮發性鹽基氮含量測定

揮發性鹽基氮含量測定（volatile base nitrogen，TVB-N）參考GB 5009.228—2016《食品中揮發性鹽基氮的測定》中第二法（自動凱氏定氮儀法）及郭學騫等[14]的方法，并稍作修改。稱取10 g搗碎后的魚肉，放入100 mL燒杯中，加入75 mL純水磁力攪拌30 min，靜置20 min，以不加樣作為空白實驗，經半自動凱氏定氮儀進行測定后，用標準鹽酸溶液（0.01 mol/L）進行滴定。TVB-N含量按式（3）計算。

式中：V1、V0分別表示試液組、空白組消耗鹽酸標準滴定溶液的體積/mL；c表示鹽酸標準滴定溶液的濃度/（mol/L）；14表示滴定1 mL鹽酸標準滴定溶液相當的氮的質量/（g/mol）；m表示試樣質量/g；100表示計算結果的換算系數。

1.4 數據統計與分析

實驗設3 次平行，采用Excel 2016軟件對數據進行處理，結果取平均值。采用SPSS 23.0軟件進行鄧肯氏單因素顯著性差異分析和皮爾遜相關性分析。采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同溫度下氣調羅非魚片的水分變化

2.1.1 橫向弛豫T2各峰面積的變化

圖1 不同貯藏溫度下氣調魚片各橫向弛豫時間峰面積的變化Fig. 1 Changes in peak areas of transverse relaxation times in modified atmosphere packaged fish fillets at different storage temperatures

魚片的水分LF-NMR圖出現3～4 個峰，與其他研究結果[15-19]一致。根據T2可將魚片中水分狀態劃分為結合緊密的結合水T21（0.1～10 ms）、具有一定束縛力的不易流動水T22（10～100 ms）和流動性較大的自由水T23（100～1 000 ms）。LF-NMR的峰面積能表征水分含量，其所對應的峰面積如圖1所示，所有處理魚片的自由水和不易流動水占的比例較高，結合水的比例較少。從圖1A可以看出，隨貯藏時間延長，4 組的總體含水量皆呈下降趨勢，前7 d總峰面積下降幅度很大，在第7天時，-18 ℃貯藏組的魚片持水能力最強，其次是-4 ℃組，而-8、-12 ℃組的魚片含水量最低。可能的原因是短期貯藏時，高溫能暫時保持魚肉較高的品質，且冷凍干耗效應短期內差異不明顯。

由圖1B可知，結合水是魚肉中與蛋白質結合最緊密的水，在貯藏的前7 d，峰面積A21呈下降趨勢，說明貯藏初期魚片結合水含量降低，表明該階段魚肉的品質發生劣變很快，結構逐漸松散。7～21 d內，-8、-12、-18 ℃組出現水分回升，而-4 ℃組魚片結合水含量一直減少，說明低溫有利于魚片的長期貯藏。21 d時，4 組魚片結合水含量出現顯著性差異（P＜0.05），直到28 d時，-4 ℃貯藏的魚片結合水含量最低，其次為-18 ℃組，-8、-12 ℃組結合水含量無顯著性差異。

由圖1C可知，新鮮魚片的不易流動水含量很高，接近總含水量。貯藏初期，不易流動水含水量快速下降，說明冷凍對不易流動水影響很大。隨著貯藏時間的延長，不同組別之間出現顯著性差異（P＜0.05），且28 d時，-4 ℃貯藏魚片的A22最低，-8、-12 ℃組魚片A22居中，-18 ℃貯藏魚片的不易流動水含量最高。

自由水是流動性最大的水，受分子間束縛力較弱。由圖1D可知，第7天時，各組組間自由水含量呈現顯著性差異（P＜0.05），新鮮魚片的自由水含量低，速凍后隨貯藏時間的延長，自由水含量總體呈上升趨勢，與其他研究結果[4,20]一致，貯藏末期時，4 組的魚片自由水含量為：-4 ℃組＞-8 ℃組＞-12 ℃組＞-18 ℃組。說明溫度越高，自由水含量越高。

綜上可得，貯藏期內，A21總體變化較小，A22逐漸減少，而A23逐漸增加，說明不易流動水逐漸向自由水轉化，使得自由水的含量升高，原因可能是冷凍使得魚肉組織之間的肌原纖維蛋白降解，結合鍵斷裂導致水分流失。

2.1.2 不同貯藏溫度下氣調魚片低場NMR成像

如圖2所示，選取魚片中心位置，將中心位置分為兩層，按新鮮魚片以及28 d時-4、-8、-12、-18 ℃ 4 組MRI圖進行排列，4 種溫度下的魚片MRI圖亮度有較明顯的變化，新鮮魚片顏色紅黃相間，分布均勻，含水量較高。由圖2顏色可得，各組魚片含水量由大到小依次為-18 ℃組＞-12 ℃組＞-4 ℃組＞-8 ℃組，而-18、-12、-8、-4 ℃總含水量峰面積分別為5 379、5 379、5 385、5 383，無顯著差異，產生這種微小差別的主要原因可能是NMR在弛豫時間測定之后進行，等待的時間較長，空氣中的水分與魚片接觸，導致魚片水分發生輕微變化，解凍時人為造成的操作誤差也可能會影響魚肉的水分。綜上可得，-12 ℃與-18 ℃的氣調魚片保水性較好，這與馮愛博等[21]的研究不一致，可能是速凍預處理造成的差異。

圖2 不同貯藏溫度貯藏結束后氣調魚片中心的MRI偽彩圖Fig. 2 Magnetic resonance imaging pseudo-color images of modified atmosphere packaged fish fillets under different storage temperatures

2.2 魚片汁液流失率的變化

圖3 氣調羅非魚片貯藏過程中汁液流失率的變化Fig. 3 Changes in drip loss rate of modified atmosphere packaged tilapia fillets during storage

汁液流失率可反映肌肉的持水能力，影響水產品感官品質，產品表面因失水引起皺癟發黃時會影響消費者的購買欲望，因此保持產品水分在商業和市場上起關鍵性作用。由圖3可知，整個貯藏期內4 組汁液流失率存在顯著性差異（P＜0.05），貯藏溫度越低，魚片的汁液流失越少，越利于保持品質，與其他研究結果[22-23]一致，解凍魚片汁液流失主要是冰晶刺破細胞造成的[24]。隨貯藏時間延長，魚片汁液流失率逐漸增加，可能是與鮮魚片比較，氣調包裝中的二氧化碳在低溫下的溶解度高于常溫，與細胞液形成滲透壓，導致細胞失水[25]。第7天時，-4、-8、-12、-18 ℃組魚片在汁液流失率分別為10.23%、7.00%、9.03%、7.02%，貯藏7～21 d過程中，-8、-12、-18 ℃貯藏的魚片汁液流失率變化平緩，而-4 ℃組上升趨勢較為明顯。其中主要的原因是由于-4 ℃組在貯藏過程中保持溫度的穩定性較差，魚肉中冰晶結構不穩定，不易流動水更多地轉化為自由水，造成汁液損失。

2.3 不同貯藏溫度下氣調魚片品質的變化

圖4 不同貯藏溫度下氣調魚片各品質指標的變化Fig. 4 Changes in quality indexes of modified atmosphere packaged fish fillets under different storage temperatures

食品的色澤是品質評價的重要指標之一，利用顏色能判斷魚肉的新鮮程度。由圖4A可知，4 個溫度下貯藏的魚片顏色變化隨著貯藏期延長而增加。第7天時，-4、-12 ℃組魚片的ΔE出現顯著性差異（P＜0.05），而-8、-18 ℃兩組魚片ΔE無顯著差異；21 d時，-4、-8、-12、-18 ℃貯藏的魚片的ΔE分別為15.68、12.45、11.77、8.90，說明-4 ℃的魚片色澤變化最快，-18 ℃魚片的色澤變化相對較小，而-8、-12 ℃魚片ΔE相近，并且更接近于-18 ℃魚片。研究過程中發現-4 ℃的魚片在半個月左右顏色開始變暗，隨后開始發白，最后顏色接近灰色，而其他3 組顏色保持較好，-18 ℃是抑制色澤變化的最佳溫度，-8 ℃與-12 ℃次之。主要原因可能是溫度對氣體溶解度產生影響，二氧化碳酸化導致酸堿度下降，減弱了血紅素與蛋白質的結合，盒中氧氣加快其氧化作用，使肌紅蛋白生成氧合肌紅蛋白進一步生成高鐵肌紅蛋白，導致貯藏后期顏色產生顯著性差異（P＜0.05）。

由圖4B可知，除-18 ℃組的魚片pH值總體呈下降趨勢外，其他3 組魚片的pH值呈先降后升的趨勢，是由于初期肌糖原無氧酵解產生的乳酸以及ATP分解生成的磷酸根離子等使pH值下降，隨著磷酸酯酶活力被逐漸增多的乳酸抑制，肌糖原不能繼續分解，乳酸也不再產生，此時為最低pH值，而后期由于含氮物質不斷分解生成堿性物質使pH值回升。第14天時，-4、-8、-12 ℃組魚片的pH值分別降至6.16、6.23、6.25，顯著低于-18 ℃組；14～21 d，這3 組pH值開始升高，-4 ℃組魚片pH值上升較快，-8 ℃與-12 ℃組相對較慢。

由圖4C可知，從0～14 d，4 組魚片的TVB-N含量緩慢增長，均未超過10 mg/100 g，21 d時，4 組魚片的TVB-N含量差異顯著（P＜0.05），-4、-8、-12、-18 ℃組魚片的TVB-N含量分別為13.72、11.62、11.06、10.36 mg/100 g，這與楊宏旭[26]的研究結果較為一致；貯藏末期，-4 ℃組已超過15 mg/100 g，而其他3 組含量均接近13 mg/100 g。根據GB/T 21290—2018《凍羅非魚》[27]，凍羅非魚片的TVB-N的限量為不高于20 mg/100 g，因此氣調羅非魚片在28 d的貯藏期內都是合格的。TVB-N含量的增加是因為魚肉中的蛋白質和非蛋白質的含氮化合物在酶和細菌等作用下發生了降解，產生了氨以及胺類等揮發性堿性含氮化合物；造成4 組魚片TVB-N含量形成差異的原因可能是低溫能抑制微生物的繁殖生長，氣體作用下延長酸性環境的持續，進而控制魚肉中蛋白質被微生物分解的速率，進一步抑制揮發性鹽基氮含量的增加。

如圖4 D 所示， 魚片菌落總數的初始值為2.34（lg（CFU/g）），整個貯藏期的菌落總數呈現先慢后快的增長趨勢。0～14 d時，細菌生長速率較慢，原因可能是微生物對冷環境有個過渡期，減緩了細菌生長的速率；14～21 d，4 組魚片的菌落總數出現顯著性變化（P＜0.05），21 d時，-4、-8、-12、-18 ℃組魚片的菌落總數分別為4.2 0、3.8 3、3.6 4、3.53（lg（CFU/g）），-8、12 ℃組魚片菌落總數與-18 ℃組接近；28 d時，4 組魚片菌落總數均未超過5.00（lg（CFU/g））。其主要原因可能是低溫結合二氧化碳溶解于魚片表面抑制了微生物生長[28-29]，達到雙重抑菌效果。

2.4 不同狀態水與魚片品質指標的相關性

表1 不同狀態水與魚片品質指標的皮爾遜相關性Table 1 Correlation between water states and fish fillet quality indicators

表1 是魚片不同狀態水峰面積與品質指標的相關性分析。-4 ℃組A與汁液流失率呈顯著負相關（P＜0.05）；-12、-18 ℃組總水分峰面積A與ΔE呈極顯著負相關（P＜0.01），與汁液流失率呈顯著負相關（P＜0.05）。-4、-12、-18 ℃組結合水峰面積A21與ΔE、汁液流失率呈顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）負相關。4 組魚片的不易流動水峰面積A22與ΔE、汁液流失率整體上呈顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）負相關。-4、-8 ℃的自由水峰面積A23與TVB-N含量、ΔE、汁液流失率呈正相關。綜上可得，不同狀態水峰面積與指標之間的相關性都較高，且相關系數在0.6～1.0范圍內；由相關性分析可知，不易流動水含量越少，色澤變化越大，汁液流失率越高；自由水含量越高，色澤變化越大，汁液流失越嚴重。主要原因是魚肉中流失的是流動性最大的自由水，自由水流失引起色澤的改變，從而引起品質的劣變。因此，可通過測定水分含量來預測產品的品質，與Gallart-Jornet[9]、王碩[30]等的研究結果一致。

3 結 論

隨著貯藏期的延長，4 組魚片的TVB-N含量、菌落總數、ΔE、汁液流失率均呈上升趨勢。貯藏末期，-4 ℃組魚片的TVB-N含量超過15 mg/100 g，其他組均低于13 mg/100 g；色澤變化最大的是-4 ℃組，-8、-12 ℃組的色澤變化相近，且顏色接近-18 ℃的凍品。由水分遷移及水分含量分析可得，魚片不易流動水向自由水轉化，流動性逐漸增強，自由水含量增多，其中-4 ℃組的不易流動水大量向自由水轉移。由相關性結果可知，總體上，3 種狀態水的峰面積與ΔE、汁液流失率有顯著相關性，因此，可利用LF-NMR技術檢測水分快來速判定微凍氣調魚片的品質變化。綜上，延伸微凍溫度至-8、-12 ℃結合氣調包裝，其品質可與-18 ℃的凍品相媲美，又由于市場低溫設備制冷溫度限制，微凍溫度最低限調為-12 ℃，因此可將新“微凍”溫度設置為-12 ℃。