胡柚黃酮對高脂飲食誘導的肥胖小鼠模型腸道菌群的調節作用

王方杰，吳祖芳，翁佩芳，張 鑫，田 園

（寧波大學食品與藥學學院，浙江省動物蛋白精深加工技術重點實驗室，浙江 寧波 315832）

肥胖是一種慢性代謝紊亂，能夠大幅增加罹患2型糖尿病、脂肪肝、高血壓、心肌梗塞和癌癥等疾病的風險，從而導致患者生活質量下降和預期壽命縮短，故預防和治療肥胖已成為現代社會面臨的主要健康挑戰[1-2]。近年來，眾多的研究表明腸道微生物對人體健康起著至關重要的作用，能夠改善免疫系統、調節宿主代謝、平衡營養素的吸收，菌群的多樣性與機體健康息息相關[3]。與正常個體相比，肥胖宿主的腸道菌群顯示出較低的基因豐度[4-5]，適當的飲食干預可以增強腸道菌群的基因豐度并促進體質量減輕[6]。腸道菌群與肥胖的關系已成為研究的熱點，且是治療肥胖的潛在有效靶點。

許多研究表明，植物活性物質具有預防肥胖的作用，并可能通過調節腸道菌群來減輕體質量[7-9]。胡柚為蕓香科植物柚與甜橙的雜交品種，是浙江省常山縣原產的地方柑橘品種，具有鎮咳化痰、消食舒胃等功效[10]。黃酮類化合物（flavonoids，FLS）是胡柚中重要的生物活性物質，胡柚黃酮的主要成分為柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等[11]。研究表明，FLS能夠利用其抗氧化和抗炎特性在超重胰島素抵抗大鼠中發揮潛在的肥胖治療作用[12]，并降低血漿脂質濃度，改善高碳水化合物、高脂肪飲食誘導的大鼠心血管功能障礙和肥胖[13]。在FLS發揮作用的機制中，腸道菌群被認為起到核心作用，這不僅是因為一些FLS具有抑菌作用，而且也特異性地促進了部分細菌的增殖[14-15]。然而，胡柚黃酮與肥胖宿主腸道菌群間的相互作用并不清楚。本研究擬采用高脂肪飲食（high fat diet，HFD）誘導建立高脂肥胖小鼠模型，應用16S rDNA測序技術，探究胡柚黃酮對HFD小鼠腸道菌群的影響及對肥胖的調控作用，為胡柚資源的深度開發和黃酮類化合物作為功能性成分的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

實驗動物采用SPF級C57BL/6J小鼠（6 周齡，雄性，平均體質量（20±2）g），實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2013-0191，購于上海斯萊克實驗動物有限公司。

胡柚黃酮為常山胡柚干燥粉末采用乙醇浸提法得到的粗提物，經D101型大孔樹脂進一步純化，所得提取物的總黃酮質量分數為95%；標準飼料由寧波大學實驗動物中心提供；高脂飼料購自南通特洛菲飼料科技有限公司。

總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒 南京建成生物工程研究所；蘇木精-伊紅染液 武漢谷歌生物科技有限公司；DNA提取試劑盒（E.Z.N.A.?Stool DNA Kit） 美國Omega Bio-Tek公司；DL2000 DNA Marker 日本寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖（RA1011-Agarose LE-100G） 上海捷瑞生物工程有限公司；氯化鈉、異丙醇、無水乙醇、多聚甲醛 國藥集團化學試劑有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

AY-120型電子精密天平 日本Shimadzu公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器、無菌硬質糞便收集袋 上海申安醫療器械廠；Spectramax190全波長酶標儀 美國Molecular Devices有限公司；5418R小型高速冷凍離心機、5804R高速冷凍離心機德國Eppendorf 公司；MX-S/M X-F 型漩渦混合器 大龍興創實驗儀器北京有限公司；Cryotome E冰凍切片機 賽默飛世爾科技中國有限公司；ECLIPSE CI正置光學顯微鏡 日本尼康公司；L96G梯度型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 杭州朗基科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組和處理

小鼠購得后經外包裝滅菌處理立即轉入寧波大學實驗動物中心，SPF級屏障系統內進行飼養，溫度和相對濕度分別控制在（22±2）℃和（50±10）%，12 h光照和12 h黑暗交替循環，小鼠自由飲食飲水。在整個實驗期間，所有涉及動物的程序均嚴格按照中國有關實驗動物的相關飼養規范和法律規定進行。

小鼠經過1 周的適應性飼養，每組6 只，隨機分為3 組：正常對照組（CONT組）、高脂肥胖組（HFD組）、胡柚黃酮組（FLS組），實驗動物具體分組情況見表1。稱取一定量的胡柚黃酮溶解于無菌水中，避光保存，采用灌胃的方式按100 mg/（kgmb·d）的劑量對FLS組小鼠進行干預，每日1 次，CONT組和HFD組灌胃等體積無菌水（在此劑量下小鼠精神正常，無任何異常現象，無一例死亡）。實驗以第一天灌胃為第0周，共持續8 周，每周3 次記錄小鼠的體質量和攝食量并計算平均值，同時在第0、2、4、8周（分別為FLS 0、FLS 2、FLS 4、FLS 8組）收集每組小鼠的新鮮糞便樣本，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存，用于腸道菌群分析。第8周末，所有小鼠禁食過夜，通過頸椎脫臼處死小鼠，立即收集血液樣本，并在4 ℃下3 500×g離心10 min，取上層血清用于生化測定。迅速解剖小鼠，分離肝臟組織用于病理學檢測。

表1 實驗動物分組Table 1 Animal grouping

1.3.2 血清生化指標測定

小鼠血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C含量均采用南京建成生物工程研究所生產的測試盒進行檢測，測定方法嚴格按照測試盒說明進行。

1.3.3 肝臟組織病理學檢測

將新鮮肝臟組織在4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，用OTC包埋劑進行包埋。快速冷凍后切下組織切片（8～10 μm），并用油紅O染色，在光學顯微鏡200×放大倍數下觀察肝臟脂肪變性程度。

1.3.4 糞便細菌DNA提取和16S rDNA測序分析

參考文獻[16]報道的方法，采用E.Z.N.A.?Stool DNA Kit提取小鼠糞便中細菌的總DNA，并對提取的DNA樣本進行質檢，檢驗合格的樣本用于后續分析。以16S rDNA高變區中的V3+V4區為目標測序片段，采用帶Barcode的特異引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）對目標片段進行PCR擴增，每個樣品進行3 次重復。PCR擴增產物通過質量分數2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并對目標片段進行回收、純化。對純化后的PCR產物采用Quant-iT PicoGreen dsDNA檢測試劑盒在Qbit熒光定量系統上對文庫進行定量，將合格的文庫在Illumina MiSeq平臺上對樣品進行測序。

采用FLASH（v1.2.8）軟件將序列拼接成高質量Tags，并將序列建庫引入的Barcode和引物序列去除，然后采用Vsearch（v2.3.4）軟件過濾嵌合體。將序列相似度大于97%的clean tags聚類為操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。使用QIIME（v1.8.0）軟件計算樣本的Alpha多樣性，對樣本進行物種多樣性分析。通過主坐標分析計算Beta多樣性，用于評估樣本在物種多樣性中的差異。使用BLAST進行序列比對，將OTU代表序列與核糖體數據庫以及NCBI-16S數據庫對比，對每個代表性序列進行物種注釋，獲得分類學信息，在門、科、屬水平上統計樣本的群落結構組成并進行分析。

1.4 數據統計分析

所有實驗均進行3 次平行實驗，數據結果表示為平均值±標準差。運用統計軟件SPSS 17.0進行單因素方差分析，數據采用Duncan’s多重比較檢驗，當P＜0.05則認為具有統計學顯著差異。

2 結果與分析

2.1 FLS對高脂肥胖小鼠攝食量和體質量的影響

圖1 FLS灌胃期間小鼠日攝食量變化Fig. 1 Changes in daily food intake of mice during administration of FLS

各組小鼠的日均攝食量在實驗周期內基本穩定，由圖1可看出，CONT組、HFD組和FLS組小鼠的攝食量無顯著性差異（P＞0.05），表明對高脂肥胖小鼠喂食FLS不會引起小鼠的食欲下降。

圖2 FLS灌胃期間小鼠體質量變化Fig. 2 Changes in body mass of mice during administration of FLS

對8 周實驗過程中各組小鼠的平均體質量進行比較。第0周時，3 組小鼠具有相似的初始體質量。從圖2 A 中可以看出，經過8 周的高脂飲食誘導，HFD組小鼠體質量與CONT組相比具有顯著性差異（P＜0.05）；隨著胡柚黃酮樣品的灌胃處理，從第4周起，FLS組的平均體質量顯著低于HFD組（P＜0.05），第7周起具有極顯著差異（P＜0.01）。第8周實驗結束時（圖2B），FLS組的平均體質量為（28.20±0.85）g，與食物攝入量相同的HFD組平均體質量（（31.23±0.80）g）相比極顯著降低（P＜0.01）。表明FLS顯著緩解了高脂飲食誘導的肥胖小鼠的體質量增加。

2.2 FLS對高脂肥胖小鼠血清生化指標的影響

圖3 FLS灌胃對小鼠血清生化指標的影響Fig. 3 Effect of FLS on serum biochemical parameters in mice

由圖3可知，與CONT組相比，HFD小鼠的TC、TG和LDL-C濃度顯著升高，HDL-C濃度顯著下降（P＜0.05），出現高血脂癥狀，證明高脂肥胖小鼠模型誘導成功。經過胡柚黃酮干預后，同樣喂食高脂飼料的FLS組與HFD組相比較TC、TG和LDL-C濃度則顯著降低，HDL-C濃度顯著升高（P＜0.05），其中LDL-C濃度基本恢復至正常水平。

2.3 FLS對高脂肥胖小鼠肝臟病理的影響

圖4 小鼠肝臟組織學觀察（×200）Fig. 4 Histological observation of liver tissue (× 200)

由圖4可知，CONT組小鼠肝臟組織油紅O染色面積較小，脂滴也很小，肝細胞形態正常；而HFD組肝臟組織中出現肝細胞脂肪變性，脂滴數目明顯增多且呈堆積狀，融合為大塊的紅色脂滴；相比之下，FLS組肝臟切片紅色脂滴體積明顯減小，較為稀疏，呈小顆粒狀不均勻分布，肝細胞脂肪輕度變性。

2.4 FLS對高脂肥胖小鼠腸道菌群多樣性的影響

為了評價高脂飲食和FLS處理對腸道菌群多樣性的影響，利用Illumina MiSeq測序平臺對第0、2、4、8周小鼠糞便樣本進行16S rDNA測序。利用顯示組間重疊部分的Venn圖可以直觀地理解各組之間共有和獨有的OTU。由圖5A可見，所有樣品中共享1 284 個OTU總豐富度中的219 個，灌胃FLS后觀察到的OTU＞17%，與實驗初始時相同。

圖5 FLS對肥胖小鼠腸道菌群多樣性的影響Fig. 5 Effect of FLS on the diversity of gut microbiota in obese mice

表2 FLS對肥胖小鼠腸道菌群多樣性的影響Table 2 Effect of FLS on the diversity of gut microbiota in obese mice

Alpha多樣性主要反映物種豐富度和均勻度。由表2可知，隨著FLS的灌胃，與實驗第0周相比，第8周FLS組的Observed species和Chao1指數顯著升高，表明第8周小鼠腸道菌群的物種數目顯著高于實驗初期（P＜0.05）。Shannon和Simpson指數也隨著FLS處理時間的延長分別發生了顯著升高和降低（P＜0.05），腸道菌群多樣性逐漸增加并在第8周達到最大值。結果表明，FLS能夠增加高脂飲食誘導的肥胖小鼠腸道菌群的多樣性。

為了比較微生物群落之間的相似性程度，通過未加權的UniFrac計算Beta多樣性并進行主坐標分析。由圖5B可看出，雖然存在個體間差異，但經過FLS干預的肥胖小鼠腸道菌群在不同時間點彼此分開聚集，表明在8 周時間內FLS干預對腸道菌群組成有明顯影響。

2.5 FLS對高脂肥胖小鼠腸道菌群組成結構的影響

圖6 FLS對肥胖小鼠腸道菌群組成結構的影響Fig. 6 Effect of FLS on the composition of gut microbiota in obese mice

表3 擬桿菌門和厚壁菌門相對豐度變化Table 3 Changes in relative abundance of Bacteroidetes and Firmicutes

為了進一步分析FLS對腸道菌群組成結構的影響，對不同分類水平上優勢菌的相對豐度進行統計分析。門水平的聚類柱狀圖（圖6A）顯示，小鼠腸道中的優勢菌群為擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）。隨著FLS的干預，從第0周（FLS 0）到第8周（FLS 8），小鼠腸道菌群的結構逐漸改變，Bacteroidetes的相對豐度增加，Firmicutes的相對豐度減少。據文獻報道，Firmicutes/Bacteroidetes（F/B）的比值可能反映腸道微生態的平衡狀態，被視為生物體健康狀況的典型參數[4]。對3 組小鼠腸道菌群第0周和第8周Bacteroidetes和Firmicutes的相對豐度變化進行統計（表3）發現，HFD組小鼠的Bacteroidetes顯著降低，Firmicutes顯著增加，F/B比值相應增加（P＜0.05），反映出肥胖小鼠腸道微生態的失調。而隨著FLS處理時間的延長，FLS組的F/B比值從0.81逐漸下降到0.48。表明FLS能夠調節高脂飲食誘導的肥胖小鼠腸道菌群在門水平上的組成。

科水平上小鼠腸道菌群相對豐度的前2 0 名如圖6 B 所示，可以看出，擬桿菌門的普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、擬桿菌科（Bacteroidaceae）、紫單胞菌科（Porphyromonadaceae）以及厚壁菌門的毛螺菌科（Lachnospiraceae）等為主要優勢菌科。灌胃FLS后，與實驗初期（FLS 0）相比，Prevotellaceae、Bacteroidaceae、Porphyromonadaceae的相對豐度增加，Lachnospiraceae、Ruminococcaceae的相對豐度逐漸減少。表明FLS能夠調節肥胖小鼠腸道菌群在科水平上的組成結構。

用熱圖來比較屬水平上各個菌屬的相對豐度變化，由圖6C可知，隨著FLS干預時間延長，普雷沃菌屬（Prevotella）、擬桿菌屬（Bacteroides）、布勞特氏菌屬（Blautia）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、艾克曼菌屬（Akkermansia）等相對豐度明顯增加，而瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、毛螺菌屬（Lachnoclostridium）、嗜膽菌屬（Bilophila）等相對豐度逐漸下降，這與科水平上的菌群變化趨勢一致。

3 討 論

與肥胖相關的血脂水平異常，尤其是較高水平的TC、TG和LDL-C是心血管疾病的主要決定因素[17]。本研究表明，高脂肥胖小鼠經胡柚黃酮灌胃后，與HFD組相比FLS組小鼠體質量增長呈下降趨勢，血清TC、TG和LDL-C的含量顯著降低，HDL-C的含量顯著升高，肝臟組織的脂質積累程度也得到了緩解。胡柚黃酮體現的這些效果與相關文獻所報道血脂水平TC、TG和LDL-C指標相關結果一致[18-20]。此外，血清中的HDL-C水平可作為判斷動脈硬化性心血管疾病發展程度的指標[21]。胡柚黃酮能降低血清TC、TG和LDL-C水平，使血脂組成向高密度脂蛋白轉變，在一定程度上調節高脂肥胖小鼠的體內血脂水平，降低肥胖和動脈粥樣硬化等疾病的風險。肝臟是機體內脂類代謝的主要器官，攝入脂肪過多時，肝細胞會大量積累脂肪，甚至可能發生病變，形成脂肪肝[22-23]。實驗表明，HFD組小鼠肝臟細胞脂質沉積嚴重，而胡柚黃酮能夠明顯地抑制高脂飲食導致的肝臟組織脂質積累，改善肝臟脂肪變性程度，防止脂肪肝等肝臟病變的發生。

腸道菌群可能是肥胖發展過程中最重要的可變因素[24-25]，其中的幾個特定種屬可以在宿主代謝和肥胖發展中發揮重要作用[26-27]。從FLS的干預對肥胖小鼠腸道菌群變化的影響結果可以看出，胡柚黃酮的干預顯著提高了肥胖小鼠腸道菌群的多樣性，對腸道菌群的組成結構發揮了積極的調節作用，且具有一定的時間效應。由2.5節結果可知，FLS能夠促進Bifidobacterium、Blautia、Akkermansia等有益菌屬的增殖。Bifidobacterium能夠改善腸道環境、抑制腸道有害細菌的生長、提高肌體免疫力、預防便秘等，對人體健康有重要作用[28]；另有研究報道，Bifidobacterium可通過調節腸道屏障、緩解炎癥等降低體質量[27]，近幾年作為益生菌被廣泛用于針對肥胖、糖尿病等代謝疾病[29]。Blautia的相對豐度與機體腸道內短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）的含量呈正相關[30]，菌群代謝產物SCFAs對腸道屏障、菌群組成和肥胖控制有益[31]。研究證明，結腸中高濃度的丙酸和丁酸對于防止低膽固醇血癥和腫瘤的發生具有良好的效果[32]。本研究結果發現，FLS能夠顯著降低肥胖小鼠血清中LDL-C的含量，可能是通過提高腸道中Blautia等SCFAs產生菌屬的相對豐度來實現的。黏蛋白降解菌屬Akkermansia有助于改善肝功能異常和機體炎癥[27]，通過補充益生元增加肥胖小鼠體內Akkermansia的豐度可以改善相關代謝特征，逆轉高脂飲食帶來的代謝紊亂[33]。FLS的干預使Akkermansia屬豐度提高，從而改善肥胖小鼠的代謝指標。實驗結果表明FLS對肥胖小鼠腸道菌群的組成結構具有積極的調節作用，能夠增加有益菌群的相對豐度，從而對肥胖宿主的代謝產生積極的影響。

4 結 論

通過研究胡柚黃酮對高脂飲食誘導的肥胖小鼠血清和肝臟病理學及腸道菌群的調節作用，結果表明，攝入胡柚黃酮能夠明顯抑制體質量增加，使肥胖小鼠的血脂水平和肝臟脂質積累程度向正常化恢復，降低肥胖和脂肪肝等疾病的風險；能夠顯著提高肥胖小鼠腸道菌群的多樣性，在門水平上增加了Bacteroidetes的相對豐度，降低了Firmicutes的相對豐度，逆轉了菌群失調的肥胖小鼠F/B比值的升高，并通過增加特定的有益菌屬（如Bifidobacterium、Blautia、Akkermansia等）的相對豐度使肥胖小鼠的腸道菌群發生有利改變，促進細菌生成SCFAs，調節腸道屏障，改善肥胖引起的代謝紊亂。因此，胡柚黃酮在腸道菌群的調節中呈現良好的益生作用，可作為功能性食品成分預防腸道微生態的失調，通過調節腸道菌群的結構實現降脂減肥的目的。