鷹嘴豆肽對免疫低下小鼠免疫功能的影響

李睿珺，秦 勇，周雅琳，劉 偉，李 雍，于蘭蘭，陳宇涵，許雅君,2,*

（1.北京大學公共衛生學院，北京 100191；2.食品安全毒理學研究與評價北京市重點實驗室，北京 100191）

鷹嘴豆是南亞、中東、北非等地的一種主要食用豆類，因其耐干旱、耐寒冷及生物固氮等特性，廣泛種植于我國北部、西部等干旱及半干旱地區[1-2]。鷹嘴豆含有豐富的營養，是優質的植物蛋白，研究發現，其功效比值、消化吸收及生物利用率遠高于大豆等豆類[3]，因而享有“豆中之王”的美譽。鷹嘴豆肽是提取自鷹嘴豆的植物多肽，具有溶解性好、穩定性高和易于消化吸收等優點[4]。近年來研究表明，鷹嘴豆肽作為一種重要的生物活性肽，具有調節糖代謝[4]、抗氧化[5-13]、抗腫瘤[6,14-15]、促進脂肪代謝和降低膽固醇[7]、降血壓[16]等功能，但是，目前國內外關于鷹嘴豆肽對免疫功能調節作用的研究較少。本實驗通過分析鷹嘴豆肽對環磷酰胺致免疫低下小鼠的體質量、免疫臟器指數及形態、骨髓細胞核、細胞因子、白細胞計數、T淋巴細胞亞群等指標的影響，探究其免疫調節作用。以期為開發植物類多肽的保健應用提供新思路，為拓寬地區特色鷹嘴豆的商業用途提供理論依據的同時促進西部農村經濟發展。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

健康SPF級雄性ICR小鼠60 只，6～8 周齡，體質量22.0～28.0 g，生產許可證號：SCXK（京）2016-0010，由北京大學醫學部實驗動物中心提供。動物飼養在屏障環境中，溫度控制在（23±2）℃，相對濕度為50%～60%，晝夜照明時間12 h/12 h。實驗期間動物自由進食和飲水。

鷹嘴豆肽是以鷹嘴豆為原料，經過蛋白質提取、復合酶解以及多級膜分離提純等工藝步驟制得的小分子肽類混合物，大部分分子質量小于1 000 Da，主要工藝流程包括調漿乳化、浸提、蛋白酶解、離心分離、滅酶、濃縮、滅菌、噴霧干燥等步驟。依據GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》，用氨基酸自動分析儀測定鷹嘴豆肽的氨基酸組成及含量（表1）。用高效液相色譜對酶解物的相對分子質量分布進行分析，鷹嘴豆肽的相對分子質量分布見圖1。

表1 鷹嘴豆肽氨基酸組成及含量Table 1 Amino acid composition of chickpea peptide

圖1 鷹嘴豆肽相對分子質量分布Fig. 1 Relative molecular mass distribution of chickpea peptide

免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）M、IgG、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、白介素（interleukin，IL）-2、IL-2、IL-4、IL-5、IL-9和IL-17A試劑盒 南京建成生物工程研究所；酪蛋白、環磷酰胺 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

SPN3001F電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；FLUOstar Omega多功能酶標儀 德國BMG Labtech公司；E400正置熒光顯微鏡 日本Nikon公司；BFX5-320型低溫自動平衡離心機、FACS Calibur流式細胞儀 美國BD公司；MEK-6318K全自動血細胞分析儀 日本光電工業株式會社；HH·S11-1電熱恒溫水浴鍋 上海雙旭電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組及受試樣品給予

實驗動物適應性喂養3 d后，稱量其體質量記為初始體質量，并按體質量隨機分為空白組、環磷酰胺模型組及鷹嘴豆肽低、中、高劑量組，每組各12 只。實驗前3 d，除空白組外，其余各組每天腹腔注射80 mg/kgmb的環磷酰胺建立免疫低下小鼠模型[17-19]，空白組注射等量的生理鹽水。第4天起，每天灌胃空白組和環磷酰胺模型組小鼠1.6 g/kgmb酪蛋白，鷹嘴豆肽低、中、高劑量組分別灌胃0.4、0.8、1.6 g/kgmb鷹嘴豆肽溶液，灌胃體積為0.1 mL/（10 gmb），連續灌胃15 d后隔夜禁食，次日晨起檢測各項指標。

1.3.2 檢測指標

1.3.2.1 體質量和免疫臟器指數測定

適應性喂養3 d后，小鼠稱質量記為初始體質量，并根據體質量隨機分組，腹腔注射環磷酰胺3 d后稱質量記為造模后體質量，灌胃15 d后稱質量記為終末體質量。動物處死前再次稱質量，供免疫臟器指數計算時使用。各組動物摘眼球取血后斷頸處死，用電子天平稱量分離的脾臟和胸腺組織，用臟器質量（mg）除以小鼠處死前體質量（g）得到小鼠脾臟指數和胸腺指數[20]。

1.3.2.2 脾臟和胸腺形態學觀察

將稱質量后的脾臟和胸腺固定于質量分數4%的多聚甲醛溶液中，石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，顯微鏡下選取適當倍數，觀察脾臟和胸腺組織的形態學改變。

1.3.2.3 外周血白細胞計數

動物摘眼球取血后，取適量全血于乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝管中，充分混勻，用全自動血細胞分析儀對白細胞進行計數[19]。

1.3.2.4 外周血T淋巴細胞亞群檢測

動物摘眼球取血，取適量全血于EDTA抗凝管中，吸取50 μL全血于流式管，加入3 種熒光染料綴合的抗體，吹打混勻。室溫下避光孵育30 min，每隔5 min搖晃混勻，然后加入1 mL裂解液，裂解完成后加入1 mL磷酸鹽緩沖液，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，彈散細胞。加入1 mL磷酸鹽緩沖液清洗細胞，350×g離心5 min，棄上清液，加入200 μL的2%多聚甲醛溶液重懸細胞，用流式細胞儀檢測CD3+細胞、CD4+細胞及CD8+細胞亞群比例。

1.3.2.5 外周血免疫球蛋白質量濃度測定

動物摘眼球取血，3 000 r/min離心10 min制得血清，取50 μL血清，按照酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒說明書檢測血清中IgG和IgM的質量濃度。

1.3.2.6 血清中細胞因子水平測定

另取200 μL血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-9和IL-17A的質量濃度[21]。

1.3.2.7 骨髓有核細胞計數和DNA質量濃度

每組隨機選擇6 只小鼠，取其右腿股骨進行骨髓有核細胞計數：剔除股骨附著的結締組織和肌肉，用1 mL Hank’s液將骨髓沖至已經加入了EDTA的離心管內。吸取0.38 mL的鹽酸溶液（0.1 mol/L）于另一離心管，加入混勻后的骨髓液20 μL，再次混勻，靜置2～3 min待紅細胞溶解。將20 μL上述溶液注入細胞計數板進行計數。

另取剩余6 只小鼠右腿股骨進行骨髓DNA質量濃度檢測：吸取10 mL的CaCl2溶液（5 mmol/L），將骨髓注入離心管中，4 ℃環境下放置30 min，2 500 r/min離心15 min，棄上清液，向沉淀中加入5 mL 0.2 mol/L的HClO4溶液，充分混勻后在90 ℃的水浴鍋水浴15 min，冷卻至室溫，3 500 r/min離心15 min后，將20 μL上清液注入96 孔板，用多功能酶標儀在260 nm波長處測定吸光度A260nm并計算骨髓的DNA質量濃度。

1.4 數據統計分析

實驗結果均為連續變量，以平均值±標準差表示。所有數據均用SPSS 20.0軟件進行統計分析。采用單因素方差分析比較組間差異，以P＜0.05為有統計學差異的判斷標準。方差齊時，用SNK法進行兩兩比較；方差不齊時，用Tamhane’s法進行兩兩比較。

2 結果與分析

2.1 體質量和免疫臟器指數的變化

表2 鷹嘴豆肽對免疫抑制小鼠體質量和免疫臟器指數的影響Table 2 Effect of chickpea peptide on body mass and immune organ indexes of immunocompromised mice

如表2所示，各組小鼠初始體質量無統計學差異（P＞0.05），環磷酰胺造模3 d后，4 個造模組小鼠體質量與空白組相比均極顯著降低（P＜0.01），但實驗15 d后的終末體質量各組間無顯著差異（P＞0.05）。各組小鼠胸腺指數之間無顯著差異（P＞0.05）；與空白組相比，模型組、鷹嘴豆肽低劑量和高劑量組脾臟指數增大（P＜0.01）；與模型組相比，鷹嘴豆肽低、中、高劑量組脾臟指數均有降低，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 免疫臟器形態學觀察結果

鏡下脾臟HE染色切片如圖2所示，空白組脾臟組織結構清晰完整，脾小結發育良好，紅髓、白髓清楚可辨，邊緣區界限清晰。模型組紅髓與白髓界限模糊，脾小結存在破損現象，脾臟腫大。與模型組相比，鷹嘴豆肽低、中、高劑量組脾小結有所恢復，結構逐漸清晰，中、高劑量組基本恢復到空白組水平。

圖2 鷹嘴豆肽對免疫低下小鼠脾臟組織形態學變化的影響（×100）Fig. 2 Effect of chickpea peptide on morphological changes in spleen tissues of immunocompromised mice (× 100)

圖3 鷹嘴豆肽對免疫低下小鼠胸腺組織形態學變化的影響（×40）Fig. 3 Effect of chickpea peptide on morphological changes in thymus tissue of immunocompromised mice (× 40)

鏡下胸腺HE染色切片如圖3所示，空白組胸腺皮質和髓質結構清晰，皮質染色較深且面積較大，可觀察到排列緊密的淋巴細胞。模型組胸腺皮質和髓質分界不清，可觀察到皮質面積減小和髓質面積增加，皮質區淋巴細胞數量減少。與模型組相比，鷹嘴豆肽低、中、高劑量組皮質面積增加，皮、髓交界逐漸清晰，中、高劑量組基本恢復到空白組水平。

2.3 外周血白細胞數的變化

表3 鷹嘴豆肽對免疫低下小鼠外周血白細胞計數的影響Table 3 Effect of chickpea peptide on white blood cell count of immunocompromised mice

如表3所示，與空白組相比，模型組小鼠外周血白細胞計數有所下降（P＜0.05）；鷹嘴豆肽干預后，各劑量組白細胞計數逐漸恢復，與模型組相比，高劑量組外周血白細胞計數顯著增加（P＜0.05），且基本恢復到空白組水平。

2.4 外周血T淋巴細胞亞群的變化

表4 鷹嘴豆肽對免疫低下小鼠外周血T淋巴細胞亞群的影響Table 4 Effect of chickpea peptide on T lymphocyte subsets in peripheral blood of immunocompromised mice

如表4所示，各組間CD3+、CD4+、CD8+淋巴細胞比例均無顯著差異。與空白組相比，模型組各項指標均有所降低，鷹嘴豆肽干預的中、高劑量組有不同程度的恢復，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.5 外周血免疫球蛋白含量的變化

表5 鷹嘴豆肽對免疫低下小鼠外周血免疫球蛋白IgG、IgM質量濃度的影響Table 5 Effect of chickpea peptide on the contents of immunoglobulin G and immunoglobulin M in peripheral blood of immunocompromised mice

如表5 所示，與空白組相比，模型組和鷹嘴豆肽各干預組外周血I g G 和I g M 質量濃度均有所降低（P＜0.05），與模型組相比，鷹嘴豆肽低劑量組的IgG質量濃度和中劑量組的IgM質量濃度有一定程度的恢復，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.6 血清中細胞因子水平的變化

如表6所示，與空白組相比，模型組細胞因子質量濃度均增加，大部分表現出統計學差異（P＜0.05）。與模型組相比，鷹嘴豆肽中、高劑量組小鼠血清中IL-17A質量濃度顯著降低（P＜0.05），且低于空白組水平。與模型組相比，小鼠血清中IL-2質量濃度隨鷹嘴豆肽劑量增加而逐漸降低，且在高劑量組中表現出統計學差異（P＜0.05），并低于對照組水平。與模型組相比，鷹嘴豆肽低、中、高劑量組小鼠血清中IL-5質量濃度顯著降低（P＜0.05），且在中、高劑量組低于空白組水平。與模型組相比，鷹嘴豆肽低、中、高劑量組小鼠血清中IL-9質量濃度均有所降低，且在低劑量組中表現出統計學差異（P＜0.05）。與模型組相比，鷹嘴豆肽低、中、高劑量組小鼠血清中IL-4質量濃度隨鷹嘴豆肽劑量增加而降低，且逐漸恢復至空白組水平，但差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組相比，鷹嘴豆肽各干預組小鼠血清中IFN-γ差異無統計學意義（P＞0.05）。

表6 鷹嘴豆肽對免疫低下小鼠外周血細胞因子水平的影響Table 6 Effect of chickpea peptide on cytokine levels in peripheral blood of immunocompromised mice

2.7 骨髓有核細胞數和DNA質量濃度的變化

表7 鷹嘴豆肽對免疫低下小鼠骨髓有核細胞數和DNA質量濃度的影響Table 7 Effect of chickpea peptide on the number of nucleated cells and DNA content in bone marrow of immunocompromised mice

如表7所示，與空白組相比，模型組的骨髓有核細胞濃度和DNA質量濃度極顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，鷹嘴豆肽低、中、高劑量組骨髓有核細胞濃度均有不同程度的升高，在中、高劑量組表現出統計學差異（P＜0.05），且基本恢復至空白組水平。與模型組相比，鷹嘴豆肽干預后各組小鼠骨髓DNA質量濃度有不同程度的恢復，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討 論

越來越多的研究顯示，生物活性肽具有調節機體生命活動和某些特定生理活性的功能，如抗菌、抗腫瘤、抗氧化、降膽固醇、增強免疫、調節血壓等[22-24]。研究表明，多種豆類多肽具有增強免疫的作用。大豆肽能增加白細胞數量，提高血清溶血素、IgM和IgG水平，增強巨噬細胞吞噬雞紅細胞、自然殺傷細胞的活性，增加CD8+、CD11b+、CD49b+和CD56+的數量，并上調免疫相關基因的表達[25-30]。豌豆肽對免疫功能具有改善作用[31-32]。綠豆肽具有免疫調節功能，可通過抑制巨噬細胞自噬，改變細胞因子水平而發揮免疫調節活性[33]。

鷹嘴豆是一種脂肪含量較低、蛋白質功效比值較高、消化率較高的植物類食品，鷹嘴豆經蛋白酶解后得到的鷹嘴豆肽仍是一種高蛋白、低脂肪的產品，其多肽含量高，脂肪質量分數低至0.86%，且水分和灰分含量都極低。鷹嘴豆肽必需氨基酸種類齊全且相對分子質量小，易于消化吸收[34]。鷹嘴豆肽作為一種生物活性肽，現已發現有多種生物活性功能，但其調節免疫功能的研究卻鮮有報道。實驗中所用鷹嘴豆肽富含的氨基酸包括谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、精氨酸、甘氨酸、脯氨酸等，其中谷氨酸和天冬氨酸含量最高。已有研究顯示具有免疫調節功能的食源性蛋白肽多是包含2～10 個殘基和具有一定疏水性的短肽，有谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、色氨酸、酪氨酸和半胱氨酸等疏水性氨基酸的蛋白肽具有較強的免疫調節活性[35-42]。因此，推測鷹嘴豆肽的免疫活性可能與其氨基酸組成有關。

眾所周知，環磷酰胺是一種常用的細胞毒性藥物，廣泛應用于抗腫瘤治療，可抑制骨髓功能，降低白細胞數量。其細胞毒性作用是化學反應代謝產物的結果，這些代謝產物通過產生交聯來烷基化DNA和蛋白質。據報道，環磷酰胺可抑制小鼠免疫器官功能并導致體質量減輕，還能引起外周血中各種血細胞的失衡，最終導致免疫功能的抑制[43]。

本實驗通過連續3 d腹腔注射環磷酰胺，建立免疫低下小鼠模型，給予鷹嘴豆肽灌胃干預15 d，評價鷹嘴豆肽對免疫功能的調節作用。實驗選用相同飼養條件下的小鼠作為空白組，考慮到鷹嘴豆肽本身作為蛋白質水解的中間產物，也有一定的蛋白功能，故給予空白組和模型組小鼠和高劑量鷹嘴豆肽組相同劑量的酪蛋白以消除可能由于總蛋白攝入差異造成的影響。

本實驗結果顯示，各組小鼠初始體質量與終末體質量均無顯著差異，但造模后小鼠體質量降低，提示環磷酰胺具有明顯的毒性，這與以往的研究結果[44]一致。

脾臟和胸腺是機體質量要的免疫器官，胸腺是T細胞分化成熟的場所，脾臟富含B、T淋巴細胞和巨噬細胞，是免疫反應的主要場所，也是動物最大的免疫器官，它們的形態結構和功能狀態在一定程度上反映了機體的免疫情況。本次實驗中，模型組小鼠的脾臟指數較空白組顯著增加，病理檢查結果提示存在脾臟充血、水腫和增生肥大；與模型組相比，鷹嘴豆肽低、中、高劑量組脾臟指數降低，提示脾臟充血、水腫和增生肥大有所緩解。在鷹嘴豆肽干預下，脾臟和胸腺的組織形態出現了明顯改善。與空白組相比，模型組小鼠的脾臟和胸腺鏡下可見結構紊亂，發育較差，而經鷹嘴豆肽干預后，小鼠的脾臟和胸腺組織結構逐漸恢復。提示鷹嘴豆肽對兩大免疫器官有一定的保護和修復損傷的作用。

骨髓是造血過程的主要場所，也是機體質量要的免疫組織，經分化可以產生各種血細胞而發揮其生理功能，是人體免疫中不可缺少的部分[44]。白細胞因為具有吞噬功能，在抵御病原體的入侵方面起著關鍵作用，是機體中重要的免疫細胞。白細胞數量下降會導致免疫應答減弱，增加感染風險[45]。因此，骨髓和白細胞的狀況也可以反映機體的免疫情況。本實驗觀察到環磷酰胺造模后，小鼠外周血白細胞計數、骨髓有核細胞濃度和骨髓DNA質量濃度相比空白組均顯著降低，并在鷹嘴豆肽干預后出現不同程度的恢復。提示鷹嘴豆肽可以改善免疫低下小鼠的骨髓抑制狀態和免疫功能。

IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，是主動免疫后機體產生的主要抗體，在體液免疫中最為重要，在免疫監視、抗感染、吞噬和溶解靶細胞中發揮重要作用，IgM是血清中分子質量最大的免疫球蛋白，在初次免疫中占有重要地位，在機體防御機制中發揮抗感染作用，其在血清中的含量能體現機體的體液免疫功能。本實驗中，模型組小鼠血清IgG和IgM質量濃度有所降低，并在部分鷹嘴豆肽干預組得到恢復。提示鷹嘴豆肽可能通過恢復IgG和IgM質量濃度來增強機體的體液免疫。

T淋巴細胞是介導機體特異性免疫應答的主要效應細胞[46]。根據其表面標志物的不同，可分為CD3+、CD4+、CD8+等細胞亞群，其中CD3+為成熟T細胞表面標志，可代表T細胞的總體水平，CD4+細胞即輔助T細胞，在細胞免疫中起輔助作用，CD8+細胞即細胞毒性T細胞，通過降低淋巴細胞的活性，發揮抑制細胞免疫的作用。適當的CD4+和CD8+淋巴細胞亞群比例和計數是免疫調節的關鍵。T淋巴細胞亞群的不平衡會導致免疫功能紊亂，導致一系列的免疫病理改變，影響機體的免疫保護機制[47]。在本實驗中，與空白組相比，各組小鼠CD3+、CD4+、CD8+細胞亞群比例有所降低，但在鷹嘴豆肽干預的中劑量組有一定程度的恢復。說明鷹嘴豆肽對免疫低下小鼠的細胞免疫有一定的改善作用。

環磷酰胺會導致細胞因子釋放，這些因子在宿主對抗感染和炎癥的免疫應答中起著重要作用。細胞因子是由免疫細胞和某些非免疫細胞經刺激后合成、分泌的一類具有廣泛生物學活性的小分子蛋白質或肽類，通過結合相應受體后調節細胞的生長和分化，從而調控免疫應答[46]。環磷酰胺對細胞因子的影響主要是影響Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）2和TLR4信號通路，激活核因子κB，導致下游多種炎癥因子（如IL-17A、IL-2、IL-4、IL-5和IFN-γ[48-49]）的改變而產生生物學效應。本實驗中，相比空白組，多數模型組細胞因子濃度明顯升高，經鷹嘴豆肽干預后，IL-17A、IL-2、IL-5和IL-9質量濃度均顯著降低并向空白組回歸。提示鷹嘴豆肽可能通過影響IL-17A、IL-2、IL-5、IL-9等細胞因子的分泌而影響其介導的免疫反應，改善機體的免疫功能。

本實驗初步探究了鷹嘴豆肽對環磷酰胺致免疫低下小鼠的體質量、免疫臟器指數、免疫組織形態結構、外周血白細胞數量、外周血T淋巴細胞亞群、細胞因子、骨髓有核細胞和DNA濃度的影響，結果提示鷹嘴豆肽對環磷酰胺所致免疫低下小鼠的多項免疫功能均有較顯著的改善作用，為鷹嘴豆肽的進一步開發利用提供了理論依據。