老年抑郁癥病人血清miR-132和miR-182的表達及與神經營養因子的關系

曹業才 呂睿 王曉琪

抑郁癥在老年人中的發病率呈增高趨勢。老年人的神經細胞常伴有萎縮及老化的病理特征，其基因表達特征可能具有獨特性[1]。微小RNA(microRNA)能調控神經發育、細胞增殖、分化和凋亡等生命過程，其表達失調與抑郁癥發生密切相關[2]。microRNA的作用與靶基因的調控有關[3]。本研究在前期應用生物信息學對老年抑郁癥病人有差異表達的microRNA進行篩選，選擇在老年人抑郁癥病人中可能表達異常，且罕見報道的微小RNA-132(microRNA-132, miR-132)和微小RNA-182(microRNA-182, miR-182)進行研究，并應用TargetScan軟件預測到miR-132和miR-182有共同的靶基因23個，選擇關聯性最強的腦源性神經營養因子(BDNF)、人神經營養因子4(NT-4)進行研究[4]?；诖?，本研究旨在檢測老年抑郁癥病人血清中miR-132和miR-182含量，探討其意義，分析其與血清BDNF、NT-4的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 納入2017年8月至2019年6月在我院確診為抑郁癥的老年病人63例作為觀察組。入組標準：(1)符合國際疾病分類(ICD-10)中抑郁障礙的診斷標準；(2)年齡≥60歲；(3)漢密爾頓抑郁量表(HAMD-17)評分均≥17分。排除標準：(1)入院前1個月內應用過抗抑郁治療的藥物；(2)伴有惡性腫瘤；(3)家屬不同意。63例中男33例，女30例，年齡60～88歲，平均(69.5±9.5)歲，病程5～302個月，其中首發28例，復發35例(復發次數為2～8次)。選擇經體檢證實為無明顯器質性疾病及精神、神經疾病的老年人63例作為對照組，其中男32例，女31例，年齡60～80歲，平均(65.8±9.1)歲。2組性別、年齡差異無統計學意義。本研究經醫院倫理委員會批準，病人或家屬簽屬知情同意書。

1.2 資料收集 收集觀察組病人的性別、年齡、病變嚴重程度、發病時間、是否首次發病、精神障礙陽性家族史及首次發病年齡相關資料，檢測血清中BDNF和NT-4的表達量。檢測觀察組與對照組血清中miR-132和miR-182中的表達量。

1.3 方法

1.3.1 miR-132和miR-182的檢測：抽取2組的空腹靜脈血3 mL，3000 r/min離心20 min，留取血清。應用實時熒光定量PCR法(qPCR)檢測miR-132和miR-182含量。首先在血清中提取總microRNA。miR-132引物上游：5′-TCGATGTGCGAAATGTACTG-3′，下游：5′-TCGCCAACGTGTACGCTAT-3′。miR-182引物上游：5′-ACTGTGCGACGTGCGTGATG-3′，下游：5′-ACTGTGCACGTGCAAACTGG-3′。U6為內參，引物上游：5′-CACGAGAGAACGCGCATTA-3′下游：5′-GCAGTCATTCAACTCGAATC-3′。引物由廣州達瑞生物技術公司合成。嚴格按實驗要求完成操作。PCR程序設定：50 ℃ 2 min，循環1次；95 ℃ 30 s，64 ℃ 25 s，72 ℃ 25 s，15個循環；93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，31個循環。在60 ℃采集信號，記錄Ct值，以2-ΔΔCt表示miR-132和miR-182的表達量。

1.3.2 BDNF的檢測：采用ELISA法檢測病人血清中BDNF的水平。試劑盒購自武漢博士德生物技術有限公司，用450 nm的酶標儀測量各個孔內的吸光度值(OD)，依據OD值，繪制標準曲線，查取對應的BDNF值。樣本集中檢測，注意避免污染，減少人為誤差。

1.3.3 NT-4的檢測：采用Western Blot法檢測病人血清中的NT-4水平。試劑購自上海遠慕生物科技有限公司。提取分離的血清中蛋白，測定蛋白濃度后，按步驟進行蛋白變性、加樣、電泳、電轉膜及免疫雜交，加入超敏發光液，發光3 min。將膜取出放入X膠片盒曝光3 min，顯影20 s。采用Image J分析數據，以相對量作為結果進行分析。

1.4 統計學分析 數據整理后應用SAS 6.12進行分析，計量資料以均數±標準差表示，組間比較應用t檢驗；計數資料以百分表示，組間比較應用卡方檢驗；相關性分析應用Spearman相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組中miR-132和miR-182表達的比較 與對照組比較，觀察組中miR-132和miR-182高表達。見表1。

2.2 觀察組不同臨床特征病人中miR-132和miR-182表達情況比較 miR-132和miR-182在不同病變嚴重程度、發病時間和是否首次發病的病人中差異有統計學意義(P<0.05)，miR-132在有無精神障礙家族史病人中的差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 2組中miR-132和miR-182表達的比較(n=63)

表2 觀察組不同臨床特征病人中miR-132和miR-182

2.3 觀察組miR-132、miR-182與BDNF的相關性分析 Spearman相關分析顯示，miR-132和miR-182與BDNF均呈負相關(r分別為-0.56和-0.51,P分別為0.016和0.023)。

2.4 觀察組miR-132、miR-182與NT-4的相關性分析 Spearman相關分析顯示，miR-132和miR-182與NT-4均呈負相關(r分別為-0.65和-0.52,P分別為0.003和0.040)。

2.5 觀察組miR-132與miR-182的相關性 Spearman相關分析顯示，miR-132與miR-182具有正相關性(r=0.46,P=0.039)。

3 討論

老年人常具有老化及神經系統萎縮的病理改變，其發生的分子生物學機制可能較為特殊。機體中神經營養因子對維持神經細胞的形態和功能有重要價值，老年人神經細胞萎縮可以使神經細胞受損，這種損傷因素使神經營養因子表達下調，導致神經細胞形態出現損傷性改變。老年抑郁癥病人神經元結構和功能出現異常，突觸傳遞與可塑性出現明顯變化，基因表達量增加，這些均與miRNA的調節有關[5]。microRNA是復雜分子調控網絡的一部分，其發揮作用的方式是與靶 mRNA 的 3’UTR 進行結合，調節mRNA 下游的靶因子來調控細胞的病理過程[6]。本研究篩選出的miR-132和miR-182具有調節神經營養因子的作用[7-8]。BDNF和NT-4在抑郁癥中的表達降低，尤其是急性期下降更明顯，但是從急性期到恢復期較正常人血清中的表達仍為較低的水平。BDNF不僅在神經營養中起作用，還有人認為BDNF可作為判斷抑郁發作的標志物[9]。BDNF能引起神經細胞修復時新生神經元的生長，對細胞結構起到一定的保護作用[10]。NT-4在正常機體中有一定程度的表達，可以誘導干細胞分化為神經元，使前體的神經元成熟。NT-4表達下調后，通過突觸前受體信號AMPA受體的作用，減少神經細胞可塑性[11]。

本研究結果顯示，miR-132和miR-182在老年抑郁癥病人血清中高表達，且具有協同作用，提示二者是病變形成的重要影響指標。老年人神經細胞的萎縮性病變可能對miR-132和miR-182高表達有促進作用。本研究結果顯示miR-132和miR-182在不同病變嚴重程度、發病時間和是否首次發病的分組中表達有差別，提示二者對病變進展有促進作用。miR-132的表達與精神障礙家族史有關，提示miR-132可能是精神疾病遺傳性病變的調控因子。miR-132和miR-182高表達能引起神經細胞損傷和修復障礙，損傷的神經細胞可以分泌miR-132，調節神經細胞周圍的炎癥環境，這種作用需要轉化酶和炎癥小體的參與。這種作用在老年人神經細胞中的作用較為明顯，且受氧化應激反應的調節[12-13]。miR-182在機體中的作用途徑可能更多，如減少巨噬細胞和白細胞的吞噬作用，使損傷因子清除能力下降[14-15]。本研究結果顯示，抑郁癥病人血清中miR-132、miR-182與BDNF呈負相關。本研究前期進行的生物信息分析顯示，miR-132和miR-182下游共同的調控基因較多，BDNF是二者共同的靶基因，本研究也證實了二者對BDNF的調節作用，推測miR-132和miR-182對神經細胞損傷的作用與抑制BDNF的表達有關。miR-182能夠對遺傳基因進行有效的調控，對染色質修復和區段的重塑有一定價值[16]。miR-182對轉錄的調控作用可能是對BDNF調節的基礎。本研究發現miR-132與精神障礙家族史有關，提示miR-132可能對判斷遺傳因素有一定價值。miR-132具有的功能較多，其低表達狀態是神經細胞內環境的保護因素[17]，另一方面,如果miR-132增加迅速，可以引起神經細胞內炎性小體的活性增強，伴隨著氧自由基的產生及神經細胞的損傷[18]。

總之，老年抑郁癥病人血清中miR-132和miR-182表達升高，與病變的形成和進展可能有一定相關性。miR-132和miR-182可能對神經保護因子有一定的調節作用。