豬博卡病毒（重慶株）NP1部分基因的克隆測序及生物信息學分析

葉星宇，聶 奎，聶福平

（1.西南大學動物科技學院，重慶 北碚400715；2.四川省廣元市動物疫病預防控制中心，四川 廣元628000；3.重慶市出入境檢驗檢疫局，重慶 江北400020）

2009年，瑞典的Blomstroem等人從患PMWS病豬的淋巴結中分離得到一株新的細小病毒，將其暫命名為豬博卡樣病毒（Porcine Boca-like Virus）[1]。隨后，通過對其接近全長的基因組進行擴增和測序，證明了該病毒屬于博卡病毒屬，與犬博卡病毒的親緣關系較近，因此正式命名為豬博卡病毒（Porcine Bocavirus，PBoV）[2]。目前在歐洲、北美、中國、中國香港已經有PBoV感染豬群的報道，并且PBoV在患病豬中的感染率高于健康豬中的感染率，因而推測PBoV可能與某些病原體起到協同致病的作用。但幸運的是，至今尚未見有PBoV感染人的報道。

研究證實，PBoV為單股線狀DNA，其基因組大小為5.2 kb左右，包含3個開放閱讀框，ORF1編碼非結構蛋白（NS1），ORF2編碼2個衣殼蛋白（VP1和VP2），中間開放閱讀框（ORF3）編碼一個高度磷酸化的非結構性蛋白質（Nuclear Protein 1，NP1）[3-4]。穩定的NP1基因為博卡病毒所特有，對于NP1遺傳進化的研究有助于了解PBoV在國內豬群的流行的傳染源以及其遺傳變異規律，為PBoV的科學防控提供參考。本試驗通過設計一對特異性引物，對重慶地區豬群中豬博卡病毒部分NP1基因進行克隆及遺傳變異分析，報告于下。

1 材料與方法

1.1 血清來源 血液樣本采自重慶市某規模養殖場，離心后分離血清，分裝并置于-20℃凍存備檢。

1.2主要試劑 DNA提取試劑盒、r Taq DNA聚合酶、DNA片段回收試劑盒、感受態細胞JM109、pMD19-T載體試劑盒，均購自寶生物工程（大連）有限公司；UNIQ-10柱式質粒小量抽提試劑盒，購自Omega公司；氨芐青霉素（Amp），購自Invitrogen公司。

1.3引物的設計 根據GenBank已公布的PBoV-NP1基因序列，利用DNAStar和Primer 5.0軟件在其保守序列設計一對特異性引物。上游引物PBoV-F：5'-AAGGACATCTCCGAAAC-3'，下游引物PBoV-R：5'-ATGAATGCCAGTGAAA-3'，預計擴增片段大小為257 bp。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.4 病原體DNA抽提和PCR擴增 按TaKaRa公司（大連）的病毒基因組提取試劑盒說明書，從豬血清提取病毒DNA。以提取的DNA樣品為模板，進行PCR擴增，反應條件為：95℃5min；94℃30 s、56℃30 s、72℃60 s，共40個循環；72℃延伸10min。PCR產物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 PCR產物的克隆與測序 用DNA回收試劑盒回收PCR產物，與pMD19一T載體進行連接；將連接產物轉化到大腸埃希菌JM109感受態細胞，37℃培養12 h，挑取上述轉化平皿中的白色菌落，接種到含有Amp（100μg/mL）的LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜至混濁，提取質粒送寶生物工程（大連）有限公司測序。

1.6 生物信息學分析 從GenBank獲取已公布的PBoV序列及HBoV、PPV序列（見表1），并對本試驗的PboV-NP1（CQRC1-7）基因序列與公布的PBoV基因序列及HBoV、PPV基因序列進行同源性比較和系統進化分析。

2 試驗結果

2.1 NP1部分基因的克隆 用PCR方法擴增出PBoV-NP1部分基因片段，大小約為257 bp，與預期片段大小一致（圖1）。

表1 本試驗中用于PBoV系統進化分析的序列信息

圖1 重慶地區部分豬血清樣本PBoV的PCR檢測結果

2.2 PBoV-NP1基因核苷酸序列分析

2.2.1 PBoV-NP1基因序列同源性比較 測得7個豬博卡病毒重慶株NP1部分基因片段序列，擬命名PboV-NP1（CQRC1-7）。測序結果顯示，PboVNP1（CQRC1-5）及PboV-NP1（CQRC7）與PBoV瑞典標準株GU902968序列完全一致，PBoV-NP1（CQRC6）在NP1基因的第236位堿基及第269位堿基與GU902968僅有2個堿基不同（圖2）。

CQRC1-7與PBoV瑞典株GU902968同源性為99.2%-100%，CQRC-6與CQRC1-5及CQRC-7僅有2個堿基不同，同源性為99.2%。CQRC1-7與其他PBoV瑞典株及中國株的同源性均在97.3%以上，CQRC1-7與HBoV瑞典株同源性僅為32.3%～34.6%，與PPV的同源性較低，表明本試驗擴增區域內的基因較為保守（圖3）。

圖2 PBoV-NP1（CQRC1-7）與PBoV瑞典標準株NP1部分基因序列比對

圖3 豬博卡病毒NP1部分基因同源性比較

2.2.2 PBoV-NP1基因遺傳變異分析 PBoV-NP1（CQRC1-7）基因遺傳變異分析結果顯示，PBoVNP1（CQRC1-7）與HBoV st1株形成一簇，3株PPV NADL-2株與PPV中國株親緣關系很近，但其與博卡病毒屬成員的親緣關系較遠，所以這4株PPV聚在一起形成另一簇；PBoV-NP1（CQRC1-7）與GenBank公布的9個PBoV瑞典株及中國株在一個分支上，HBoV st1株單獨形成一個分支；其中，PBoV-NP1（CQRC1-5）及PBoV-NP1（CQRC7）與PBoV瑞典株（GU902968）親緣關系非常近，聚在一個分支上，PBoV-NP1CQRC6與PBoV-NP1（CQRC1-5）及PBoV-NP1（CQRC7）屬于不同的分支。PBoV-NP1（CQRC1-7）與PBoV瑞典株及中國株在同一分支上，表明PBoV的NP1基因遺傳變異較?。▓D4）。

圖4 豬博卡病毒NP1基因發育進化樹

2.3 PBoV-NP1基因氨基酸序列分析 PBoV瑞典株sw90_1株NP1基因推導，NP1蛋白全長218個氨基酸，本次試驗獲得的基因片段編碼NP1基因第30位點至111位點的82個氨基酸，根據16株PBoV的NP1基因的核苷酸序列推導了其所編碼的氨基酸序列。結果顯示，各毒株氨基酸序列之間比較，共有10個位點的氨基酸發生了變異，同源性在87.8%～100%之間。

3 討論

2010年，Blomstroem等發現了PBoV的一段編碼218個氨基酸的開放閱讀框，并證實為NP1基因，且與人類博卡病毒NP1基因序列相近，基因組兩端具有2個分別編碼NS蛋白和NP蛋白的開放閱讀框NP1基因具有較好的穩定性，是成為疫苗和藥物作用的良好靶點[5]。通過對本次試驗分離的7個病毒株NP1部分基因的測序與分析，發現7個PBoV-NP1部分基因片段其與NCBI公布的PBoV序列同源性達到97.3%～100%，其中與瑞典標準株（GU902968）同源性最高，為99.2%～100%，表明重慶地區流行的豬博卡病毒可能與PBoV標準株的親緣關系很近，推測重慶地區豬群中感染的PBoV可能是通過國外品種引進或者進口國外動物性產品而傳播感染豬群,因此，應當加強國外引種及進口動物性產品的檢驗檢疫，加強境岸檢疫，防止特定病原傳入國內。該試驗也表明PBoV的NP1基因核酸序列可能比較保守，遺傳進化速度較慢，與同科的其他病毒做遺傳變異分析，形成相對獨立的一個分支，為豬博卡病毒NP1基因功能的進一步研究奠定了一定的基礎。

[1]Blomstrom A，Belak S，Fossum C，et al.Detection of a novel porcine bocalike virus in the background of porcine circovirus type 2 induced postewaningmultisystemic wasting syndrome[J].Virus Research，2009，146：125-129.

[2]Blomstrom A，Belak S，Fossum C，etal.Studies of porcine circovirus type 2，porcine boca-like virus and torque teno virus indicate the presence ofmultiple viral infections in postweaningmultisystemic wasting syndrome pigs[J].Virus Research，2010，152：59-64.

[3]林峰，曾愛平，楊恩，等.WLL-1株博卡病毒（Boeavirus）全基因組序列分析[J].病毒學報，2007，23（1）：1-3．

[4]羅迪賢，劉巧突，林應標，等.人類博卡病毒基因組序列與進化分析[J].實用預防醫學，2006，13（6）：1430-1432.

[5]曾松林.豬新型細小病毒PHoV和PBoV診斷方法的建立、分子流行病學調查及基因組序列分析[D].武漢：華中農業大學，2010：4-5.