308nm單頻準分子光對人角質形成細胞活力及細胞因子分泌水平的影響＊

田蔚蔚 ，劉排 ，李光 ，朱永軍 ，李娟

（1.江西省皮膚病?？漆t(yī)院，南昌 330001；2.廣東省深圳怡禾星門診部，深圳 518000）

白癜風是一種由于表皮和附屬器部位黑素細胞(melanocyte，MC)特發(fā)性損害而致色素脫失的常見的獲得性皮膚病。目前其發(fā)病機制尚不完全明確，且目前仍無令人滿意的治療方法。近年來國內外已有較多的臨床研究證實308nm單頻準分子光和308nm準分子激光對白癜風的治療有效[1-4]。但其作用機制方面的研究較少，目前有研究顯示308nm準分子激光治療可能通過誘導皮損處T淋巴細胞凋亡[5]，降低CD4+和CD8+T細胞浸潤，促進調節(jié)性 T細胞及皮損處 TGF-β（transforming growth factorβ，TGF-β）和 IL-10 的分泌[6]，影響角質形成細胞的活力及不同細胞因子的分泌水平等[7-9]刺激殘存的黑素細胞聚集于外周毛囊外根鞘[10]；通過Wnt/β-Catenin信號通路刺激B16細胞的黑素生成[11]等發(fā)揮治療作用。而對于目前應用更廣、更適用于基層使用的308nm單頻準分子光的機制研究尚不明確[12]。

本研究通過研究308nm單頻準分子光照射后人角質形成細胞活力及其與黑素細胞形態(tài)功能調節(jié)相關的細胞因子如干細胞生長因子 （stem cell factor，SCF）、堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、粒-巨噬細胞集落刺激細胞生長因子 （granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）的分泌水平，來探討308 nm單頻準分子光對白癜風的可能治療機制，并通過比較不同照射劑量、不同照射時間組的比較探索劑量、照射時間對療效的可能影響，為308nm單頻準分子光應用于白癜風臨床治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 308nm單頻準分子光治療儀（美國威峰）、酶標儀（RT-6100，Rayto）、DMEM高糖培養(yǎng)基 （杭州四季青生物工程有限公司）、DMSO（Amresco公司）、0.25%胰蛋白酶（含 EDTA）（凱基生物有限公司）、青霉素鏈霉素混合液（索萊寶科技有限公司）、胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）（BI生物有限公司）、24 孔培養(yǎng)板、96 孔培養(yǎng)板 （Corning公司）、Human bFGF ELISA檢測試劑盒 （上海酶聯(lián)）、Human GM-CSF ELISA檢測試劑盒（上海酶聯(lián)）、Human SCF ELISA檢測試劑盒（上海酶聯(lián)）。

1.2 人角質形成細胞的培養(yǎng)及分組 采用HaCaT人永生化角質形成細胞株 （南京凱基生物科技有限公司），加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 MTT法測定細胞活力 將HaCaT細胞按5×103/孔的細胞密度接種于96孔板中培養(yǎng)24h，給予不同劑量（100 mJ/cm2、200 mJ/cm2、300 mJ/cm2、400 mJ/cm2、500 mJ/cm2、600 mJ/cm2） 的 308nm 單頻準分子光單次照射，對照組不予照射。經照射后的細胞培養(yǎng) 24h后，每孔加入 50μL1×MTT，在 37℃孵育4h，吸出上清液，每孔加入 150μL DMSO，用平板搖床搖勻，用酶標儀在550nm波長處檢測每孔的A值。

1.4 ELISA法檢測細胞因子分泌水平 將HaCaT細胞按105/孔的細胞密度接種于24孔板中后，給予不同劑量（100mJ/cm2、200mJ/cm2、300mJ/cm2、400 mJ/cm2、500mJ/cm2、600mJ/cm2）的 308nm 單頻準分子光單次照射，對照組不予照射，其后分別于6h、12h、24h、48h收集上清液，嚴格按照ELISA試劑盒說明書步驟操作，450nm波長測各孔吸光度值，按照標準曲線計算細胞因子 （SCF、bFGF、GM-CSF）濃度。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件的進行數據分析，細胞活力A值采用t檢驗，其余計量資料采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 308nm單頻準分子光對角質形成細胞活力的影響 308nm單頻準分子光不同照射劑量組與對照組的 A 值比較發(fā)現，100、200、300、400、500mJ/cm2五個照射劑量組的各組A值與對照組比較無顯著性差異 （P＝0.429、0.682、0.823、0.538、0.671），而600 mJ/cm2照射劑量組的A值與對照組比較有顯著性差異（F＝4.281，P＝0.015）。 （圖 1）

圖1 不同劑量308nm單頻準分子光照射后的HaCat細胞活力曲線

2.2 308nm單頻準分子光對角質形成細胞活力及其細胞因子分泌水平的影響 308nm單頻準分子光照射后可促進角質形成細胞分泌SCF，不同照射劑 量 組 （0、100、200、300、400、500、600mJ/cm2） 的SCF 濃度有統(tǒng)計學差異（F＝12.992，P＝0.000），圖 2提示在0-500 mJ/cm2范圍內，隨照射劑量的增多，分泌水平逐漸升高，但600mJ/cm2組分泌水平稍下降，其中 500mJ/cm2組明顯較 100mJ/cm2（P＝0.004）、200mJ/cm2（P＝0.017）組刺激角質形成細胞分泌的SCF 濃度更高。不同照射時間組（6h、12h、24h、48h）的 SCF 濃度有統(tǒng)計學差異 （F＝5.502，P＝0.002），其中照射 24h、48h后的 SCF濃度較 6h更高 （P＝0.003、0.022）。

308nm單頻準分子光照射后可促進角質形成細胞分泌 bFGF， 不同照射劑量組（0、100、200、300、400、500、600mJ/cm2） 的 bFGF 濃度有統(tǒng)計學差異（F＝46.967，P＝0.000），圖 3 提示在 0-400 mJ/cm2范圍內，隨照射劑量的增多，分泌水平逐漸升高，但500mJ/cm2、600mJ/cm2組分泌水平稍下降，其中 400mJ/cm2組明顯較其他組（0、100、200、300、500、600mJ/cm2）刺激角質形成細胞分泌的SCF濃度 更 高 （P ＝0.000、0.000、0.000、0.004、0.004、0.000）。 不同照射時間組（6h、12h、24h、48h）的 SCF濃度有統(tǒng)計學差異（F＝3.892，P＝0.012），其中照射12h 后的 bFGF 濃度較 6h、48h 更高 （P＝0.002、0.040）。

圖3 不同劑量308nm單頻準分子光照射后的HaCat細胞分泌bFGF濃度變化

308nm單頻準分子光照射后可促進角質形成細胞分泌GM-CSF，各照射劑量組的GM-CSF濃度高于非照光組（P＜0.05），但不同照射劑量組的組間差異并無統(tǒng)計學意義 （F＝8.615，P＝0.212）， 圖 4提示500mJ/cm2組分泌水平稍高于其它照射劑量組（100、200、300、500、600mJ/cm2），但并無統(tǒng)計學差異（P＝0.079、0.591、0.887、0.105、0.481）。 不同照射時間組（6h、12h、24h、48h）的 SCF 濃度有統(tǒng)計學差異（F＝3.920，P＝0.012），照射 12h 濃度達到高峰值，高于 24h照射組（P＝0.037），但與其它時間點（6h、48h）無統(tǒng)計學差異（P＝0.995、0.574），但照射24h 后的 GM-CSF 濃度較 6h、12h 低 （P＝0.044、0.037）。

3 討論

圖4 不同劑量308nm單頻準分子光照射后的HaCat細胞分泌GM-CSF濃度變化

目前白癜風尚缺乏療效滿意的治療方案。而自從2003年Leone G等首次報道了308nm準分子激光在37例白癜風患者中的有效應用后[13]，其后多項研究亦證實308nm準分子激光及單頻準分子光在白癜風治療中的有效性[1-4]，且其較其他光療方法（PUVA、NB-UVB）更為有效，著色更快，累積劑量更小，且不良反應如對周圍正常皮膚的刺激性、致癌性等均較小[4]。同時其亦可有效應用于其它色素異常性疾病，均從側面驗證其促進黑素生成的作用[14]。目前308nm準分子激光及單頻準分子光已納入白癜風的一線治療方案中。

308nm單頻準分子光及308nm準分子激光雖波長相同，但是兩者所用機器不同，輻射特性、發(fā)光方式亦有差異。Duff等一項隨機對照試驗顯示，兩者在白癜風治療中的療效類似[15]，且308nm準分子激光的費用較308nm單頻準分子光約貴十倍，因此后者較前者應用性更為廣泛，尤其適用于基層醫(yī)院。目前308nm單頻準分子光的機制研究尚欠缺。張勇等發(fā)現308nm單頻準分子光可以使角質形成細胞分泌的SCF轉錄水平和蛋白水平表達均增加，其可能通過促進角質形成細胞SCF的表達而對白癜風起到治療作用[12]。

本研究提示308nm單頻準分子光照射劑量在100-500mJ/cm2之間時并未影響角質形成細胞的活力，但600mJ/cm2的照射劑量下，角質形成細胞活力稍下降，該研究結果與其它研究中的308nm單頻準分子光及308nm準分子激光類似[8，12]，而與NB-UVB的研究相比較，其影響角質形成細胞活力的照射劑量更高，可能由于308nm單頻準分子光和308nm準分子激光較其他光療方法如NBUVB光譜更窄，也可能解釋了308nm單頻準分子光及308nm準分子激光較其它光療方法如NBUVB副作用如紅斑效應、致癌性更小。

本研究測定細胞因子的分泌水平結果提示308nm單頻準分子光可促進角質形成細胞分泌SCF、bFGF、GM-CSF三種細胞因子，SCF參與正常黑素細胞功能的表達，可與表達于黑素細胞上的配體KIT結合，活化酪氨酸激酶通道，對黑素細胞的發(fā)育、增殖、分化和黑素的合成發(fā)揮著重要作用[7，9，12]。GM-CSF 在 UVA 誘導的色素沉著中作為黑素細胞的一種內在刺激物，能誘導受UVB照射的角質形成細胞增殖和分化[9，16]；bFGF則是MC的自然促分裂因子和天然絲裂原，可激活蛋白激酶2，促進MC進入S期，誘導MC的增殖分化和黑素的合成[8，9]。

不同照射劑量組的對比結果提示400-500mJ/cm2范圍內SCF、bFGF的分泌水平隨著照射劑量的增加而增多，該檢查結果與既往308nm準分子激光的研究結果部分相符[7-9，12]，其與臨床上觀察到的治療效果隨照射劑量的增加而增強的情況相符，600mJ/cm2組分泌水平開始下降，不排除與細胞活力下降有關。而本實驗為體外細胞研究，細胞活力受損后其余細胞增殖代償情況體外與體內有異，因此在臨床上患者出現副作用如水皰形成時的治療劑量與體外實驗觀察到的細胞活力受損的照射劑量并不相符，但可以推測在細胞活力嚴重受損（患者出現明顯副作用）之前，為提高治療效果，可逐漸提高照射劑量。而各照射劑量組之間的GM-CSF的分泌水平比較結果提示，雖500mJ/cm2組稍高于其他劑量組，但差異并無統(tǒng)計學意義，結合既往308nm準分子激光的研究結果，在今后關于治療機制的進一步體外實驗研究中更推薦使用SCF、bFGF兩種因子而非GM-CSF。

而不同照射時間組的對比研究提示在照射后的12-24h細胞因子分泌水平達高峰期，其后漸下降，因此在臨床治療過程中推薦治療間隔時間為2-3d，其治療效果明顯優(yōu)于一周一次的治療間隔[3，4]。

因本實驗僅檢測細胞上清液中的分泌型細胞因子水平，僅提示角質形成細胞經308nm單頻準分子光照射后，釋放分泌型細胞因子的能力，而對于細胞型細胞因子的水平、細胞因子的mRNA表達水平等方面的探索尚需進一步的研究證實。