瑞芬太尼通過調控FAM96B表達對骨肉瘤細胞增殖、凋亡影響的機制

鐘慶 趙偉 汪輝德 楊岸 翁艷 羅志剛 黃光平 楊國仁

(1簡陽市人民醫院麻醉疼痛科，四川 簡陽 641400;2南方醫科大學珠江醫院麻醉科；簡陽市人民醫院 3中心實驗室；4骨科)

瑞芬太尼作為一種麻醉藥，其在乳腺癌、胃癌、肺癌、肝癌、直腸癌、宮頸癌中均具有一定的治療作用〔1～3〕，但是其在骨肉瘤中的作用及機制知之甚少。96序列相似的家庭成員B(FAM96B，MIP18，CGI-128)位于16q22.1-q22.3，含有163個氨基酸，分子量為18 kD〔4，5〕。目前國內外關于FAM96B在癌癥中的研究甚少，其在骨肉瘤中的作用尚未有人報道。本研究擬以骨肉瘤細胞SAOS-2為研究對象，觀察瑞芬太尼及FAM96B對骨肉瘤細胞增殖、凋亡的影響，探討瑞芬太尼發揮作用的機制與調控FAM96B的關系。

1 材料與方法

1.1材料 人骨肉瘤細胞SAOS-2購自ATCC；DMEM培養基、胎牛血清、噻唑藍(MTT)、胰蛋白酶均購自美國GIBCO公司；LipofectamineTM2000、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、逆轉錄試劑盒購自大連Takara公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自德國羅氏診斷有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒、增強型化學發光(ECL)液和放射免疫沉淀測定(RIPA)蛋白裂解液均購自碧云天生物技術公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 將人骨肉瘤細胞SAOS-2用含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于37℃，5%CO2的恒溫培養箱中常規培養，待細胞生長至融合度75%左右，用胰蛋白酶消化約1 min，按照1∶3的比例更換培養基，每2 d傳代一次。

1.2.2細胞分組 將瑞芬太尼(0.0、0.5、5.0、50.0、500.0 ng/ml)與SAOS-2共培養24、48、72 h，用MTT法檢測其對SAOS-2的抑制率，選擇最適濃度(50.0 ng/ml)和時間(48 h)。將瑞芬太尼50.0 ng/ml處理48 h的SAOS-2標記為瑞芬太尼組；si-NC是作陰性對照，正常的SAOS-2標記為(Con)組。為了研究FAM96B對正常的SAOS-2和瑞芬太尼處理的SAOS-2的增殖、凋亡影響，將pcDNA、pcDNA-FAM96B、瑞芬太尼+si-NC、瑞芬太尼+si-FAM96B用脂質體轉染至SAOS-2，然后部分組用瑞芬太尼50.0 ng/ml處理48 h，分別標記為pcDNA組、pcDNA-FAM96B組、瑞芬太尼+si-NC組、瑞芬太尼+si-FAM96B組，qRT-PCR法檢測轉染效率，轉染成功后，用于后續實驗。

1.2.3qRT-PCR實驗 取適量對數生長期1.2.2各組細胞，遵照RNA抽提試劑盒說明書要求操作提取RNA，進行定量，然后按逆轉錄試劑盒按照說明書操作合成cDNA。最后按qRT-PCR試劑盒說明書操作進行FAM96B、Bcl-2、Bax 的mRNA檢測。用2-△△Ct計算FAM96B、Bcl-2、Bax的表達。

1.2.4Western印跡實驗 收集1.2.2各組細胞，加入裂解液，冰上裂解30 min。12 000 r/min離心10 min。取上清置于EP管，加入SDS上樣緩沖液，沸水煮沸10 min。電泳后用轉膜儀將蛋白轉移至PVDF膜；5%脫脂奶粉將膜封閉2 h，洗膜，加入Ⅰ抗，4℃過夜孵育，洗膜，加Ⅱ抗，4℃ 2 h。加發光液，曝光。

1.2.5MTT實驗 取適量1.2.2各組細胞，加入20 μl 5 g/L的MTT溶液，培養4 h，然后棄去上清，每孔加入150 μl DMSO，震蕩，使結晶溶解，在490 nm波長下檢測細胞吸光度(A)。細胞抑制率=〔1-A490樣品/ A490對照〕×100%。

1.2.6膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC/PI)流式細胞術實驗 將1.2.2各轉染組細胞，用 500 μl 的結合緩沖液懸浮細胞，分別加入5 μl的 Annexin V-/FITC避光反應20 min后再加入5 μl的PI避光反應20 min，用300目銅篩過濾，最后在1 h內上流式細胞儀結束檢測。細胞的凋亡率(%)= 早期凋亡率+晚期凋亡率。每個樣品重復3次。

1.3統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行方差分析，t檢驗。

2 結 果

2.1不同濃度瑞芬太尼不同時間抑制率比較 與24、72 h相比，處理48 h的SAOS-2的抑制率最合適。與0.0 ng/ml組相比，0.5、5.0、50.0、500.0 ng/ml組SAOS-2的抑制率均顯著升高，且呈顯著的濃度依賴性。故選用作用時間48 h，抑制率為50%左右的濃度(50 ng/ml)用作后續實驗。見表1。

表1 不同濃度瑞芬太尼不同時間抑制率比較

2.2瑞芬太尼對骨肉瘤SAOS-2凋亡的影響 與Con組〔(8.13±0.84)%〕相比，瑞芬太尼組SAOS-2的凋亡率顯著升高〔(23.56±1.98)%，P<0.05〕。見圖1。

圖1 細胞凋亡流式圖

2.3瑞芬太尼對骨肉瘤SAOS-2凋亡相關基因表達的影響 與Con組相比，瑞芬太尼組SAOS-2中Bcl-2 mRNA和蛋白表達均顯著降低，Bax mRNA和蛋白表達均顯著升高(均P<0.001)。見表2，圖2。

表2 瑞芬太尼對骨肉瘤SAOS-2細胞中凋亡相關蛋白表達的影響

圖2 瑞芬太尼對骨肉瘤SAOS-2細胞中Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

2.4瑞芬太尼對骨肉瘤SAOS-2中FAM96B表達的影響 與Con組相比，瑞芬太尼組SAOS-2中FAM96B mRNA和蛋白表達均顯著升高(均P<0.001)。見表3，圖3。

表3 瑞芬太尼對骨肉瘤SAOS-2細胞中FAM96B表達的影響

圖3 Western印跡檢測瑞芬太尼對骨肉瘤SAOS-2細胞中FAM96B蛋白表達的影響

2.5FAM96B過表達對骨肉瘤SAOS-2增殖和凋亡的影響 與pcDNA組相比，pcDNA-FAM96B組SAOS-2中FAM96B蛋白表達顯著升高，抑制率、凋亡率均顯著升高，Bcl-2蛋白顯著降低、Bax蛋白顯著升高(均P<0.001)。見圖4，表4。

圖4 FAM96B過表達后FAM968及凋亡相關蛋白的影響

表4 FAM96B過表達對骨肉瘤SAOS-2細胞增殖和凋亡的影響

2.6抑制FAM96B表達逆轉了瑞芬太尼對骨肉瘤SAOS-2細胞增殖和凋亡的作用 與Con組相比，瑞芬太尼組SAOS-2細胞中FAM96B蛋白表達顯著升高，抑制率、凋亡率均顯著升高，Bcl-2蛋白顯著降低、Bax蛋白顯著升高；與瑞芬太尼+si-NC組相比，瑞芬太尼+si-FAM96B組SAOS-2細胞中FAM96B蛋白表達顯著降低，抑制率、凋亡率均顯著降低，Bcl-2蛋白顯著升高、Bax蛋白顯著降低(P<0.001)。見表5，圖5。

表5 抑制FAM96B表達逆轉了瑞芬太尼對骨肉瘤SAOS-2細胞增殖和凋亡的作用

1～4：Con組、瑞芬太尼組、瑞芬太尼+si-NC組、瑞芬太尼+si-FAM96B組圖5 抑制FAM96B表達逆轉了瑞芬太尼對骨肉瘤SAOS-2細胞中FAM96B和凋亡相關蛋白表達的作用

3 討 論

瑞芬太尼是一種超短效的麻醉性鎮痛藥，主要用于全身麻醉的誘導和維持鎮痛，其最常用的方法是通過微量注射泵持續的泵入靜脈給藥。據報道，阿片類藥物瑞芬太尼具有抗癌作用〔6〕，其在胰腺癌中具有通過失活蛋白激酶B(AKT)通路抑制癌細胞增殖并促進其凋亡的功能〔7〕。Yoon等〔8〕研究中發現，瑞芬太尼可通過失活細胞外調節蛋白激酶(ERK)抑制破骨細胞的分化和成熟，并減少骨吸收。Solari等〔9〕研究中報道，瑞芬太尼有益于骨肉瘤患者的預后。本研究結果說明瑞芬太尼具有明顯的抗骨肉瘤功能；瑞芬太尼促進骨肉瘤細胞凋亡的機制與調控Bcl-2、Bax的表達相關，也為瑞芬太尼在骨肉瘤手術中的應用提供充分的理論依據。本文Western印跡檢測發現，瑞芬太尼可上調FAM96B的表達。

FAM96B是一種高度保守的蛋白，其可通過堿性螺旋-環-螺旋蛋白E2-2、核苷酸切除修復蛋白同源物(MMS19)、腺嘌呤核苷酸轉位蛋白(ANT)2，細胞溶質鐵硫蛋白組裝(Ciao)1及細胞的有絲分裂過程〔10～13〕。馬丹丹〔14〕研究報道，FAM96B在肺癌、肝癌的組織和細胞中的表達水平均顯著升高，過表達FAM96能夠抑制肺癌細胞和肝癌細胞的增殖，促進其凋亡，得到FAM96B也許在癌癥中發揮癌基因的功能。葉家欣等〔15〕、蔡遜等〔16〕研究發現，FAM96B在胃癌、結直腸癌組織中表達顯著降低，過度表達FAM96B可抑制癌細胞的增殖，促進其凋亡。本研究結果說明瑞芬太尼上調FAM96B在骨肉瘤中發揮調控作用。進一步研究說明上調FAM96B具有與瑞芬太尼相同的抑制骨肉瘤細胞增殖，促進凋亡的作用，更充分的說明瑞芬太尼上調FAM96B發揮抗骨肉瘤的功能。深入研究說明不僅瑞芬太尼具有上調FAM96B發揮抗骨肉瘤的功能，相反，FAM96B也具有逆向調控瑞芬太尼的抗癌功能。

綜上所述，瑞芬太尼可抑制骨肉瘤細胞的增殖，促進其凋亡，其作用機制與上調FAM96B有關，為瑞芬太尼臨床用于骨肉瘤手術麻醉提供新的支持。