pH和緩沖作用對香菇菌絲生長的影響

段應策，胡姿儀，楊帆，李金濤，鄔向麗，張瑞穎

（中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所/農業部農業微生物資源收集與保藏重點實驗室，北京 100081）

0 引言

【研究意義】香菇（Lentinula edodes）是中國食用菌中重要的大宗栽培種類，不僅味道鮮美，還有非常高的營養價值和藥用價值，深受市場歡迎。近年來香菇生產規模不斷擴大，栽培技術也發生了巨大的變化，工廠化制棒和液體菌種技術開始廣泛應用。工廠化制棒對質量控制提出了更高的要求，pH是衡量培養料質量和培養條件的一個重要指標[1]，在香菇菌棒工廠中，大量木屑通常是露天堆放，被雨淋濕后，易發酵變酸[2]。生產中通常添加石灰將木屑 pH調至6.0—7.0，但仍然經常出現菌絲生長緩慢甚至不萌發的現象。在液體菌種發酵過程中，pH不斷下降，后期有時能降至pH 2.5以下，對菌種質量的影響尚不清楚。因此，亟需深入研究pH對香菇菌絲生長的影響機制，為香菇生產和新技術的開發應用提供理論依據。【前人研究進展】pH是影響食用菌生長發育的一個重要因子。不同食用菌對 pH的要求不同，平菇（Pleurotus ostreatus）能在pH 4.0—7.0的范圍內生長，但pH 6.0時生長速度最高[3]，金針菇（Flammulina velutipes）液體發酵的最適pH為5.5—7.4[4]，黑木耳（Auricularia heimuer）菌絲生長的最適pH為7.0[5]。有些食用菌生長發育過程中基質pH是動態變化的，香菇菌棒在培養過程中，pH不斷下降，在出菇前達到pH 4.0，有報道建議將pH 4.0作為衡量香菇菌棒生理成熟的一個指標[6]。大多數真菌通過合成草酸調控基質pH[7]，草酰乙酸水解酶和乙醛酸脫氫酶是真菌合成草酸的主要酶[8-10]，香菇中草酰乙酸水解酶基因已經被成功克隆[11]。【本研究切入點】香菇菌絲能夠在pH 3.0—7.0的范圍內生長，傳統上認為香菇對基質pH的適應性較強，缺乏精確和系統的研究。【擬解決的關鍵問題】本研究為了探索 pH對香菇菌絲生長的影響，首先利用HCL和NaOH調節PDA培養基pH，檢測菌絲生長的最適pH；然后分析木屑中尤其是酸化木屑中的有機酸，利用有機酸、鈣鹽和緩沖液調節培養基pH，檢測其對香菇菌絲生長的影響，揭示 pH和緩沖作用對香菇菌絲生長的影響機制。

1 材料與方法

試驗于 2017年在中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所進行。

1.1 菌株

香菇菌株由國家食用菌標準菌株庫（China center for mushroom spawn standards and control，CCMSSC）提供，編號為CCMSSC 04311，品種名為L808，是國內常用的一個主栽品種。

1.2 培養基制備

為了檢測有機酸和鈣鹽對香菇菌絲生長的影響，在PDA培養基（DifcoTM）中分別添加有機酸和鈣鹽，有機酸為檸檬酸和乳酸；鈣鹽為檸檬酸鈣、乳酸鈣、硫酸鈣和碳酸鈣。每種物質設置3個濃度，分別為5、25和50 mmol·L-1。未添加有機酸和鈣鹽的PDA培養基作為對照（CK）。

為了檢測pH對香菇菌絲生長的影響，設計5個pH梯度，分別為pH 3.0、pH 4.0、pH 5.0、pH 6.0和pH 7.0。利用3種方法分別調節PDA培養基的pH，第一種是用鹽酸和氫氧化鈉溶液調節；第二種是利用25和50 mmol·L-1的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（CBS）調節；第三種是利用25和50 mmol·L-1磷酸-磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液（PBS）調節。利用平面樣品pH電極（梅特勒）測定PDA培養基的pH。

1.3 木屑中有機酸的提取

從香菇菌棒廠分別取酸化木屑和正常木屑，用塑料袋封裝帶回實驗室。稱取10 g木屑樣品，加20 mL水，勻漿；超聲波處理30 min；50℃水浴30 min；10 000 r/min離心 10 min，取10 mL上清液，用0.22 μm過濾器過濾，用pH電極（梅特勒）測定pH。

1.4 GC-MS分析

利用GC-MS進行有機酸的定性分析。GC-MS分析之前，利用硅烷化方法對樣品進行衍生化處理[12-13]。將過濾液冷凍干燥；加100 μL甲氧胺的吡啶溶液（20 mg·mL-1），38℃反應 90 min；加入 100 μL的 N-甲基三甲基硅基三氟乙酰胺（N-methyl-N-trimethylsilytrifluoroacetamide，MSTFA）反應30 min。

有機酸樣品衍生化之后直接進行GC-MS分析[14]，色譜柱為DB-5MS（50 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫條件為70℃保持2 min，4℃·min-1升至300℃，保持10 min；質譜掃描范圍為33—500 m/z；進樣量1 μL；內標為己二酸。

1.5 HPLC分析

利用HPLC進行有機酸的定量分析[15-16]，儀器為Agilent1100，有機酸分析柱 SB-Aq，4.6 mm×150 mm，5 μm；流動相為硫酸溶液（pH 1.96）和甲醇（色譜級），配比為 9﹕1；柱溫為 30℃；流速 0.3 mL·min-1；檢測波長為210 nm。根據標準品制作的標準曲線，計算樣品中有機酸的含量。

1.6 生長速度測定

每個培養皿裝20 mL培養基，接種后25℃避光培養，利用游標卡尺測量菌落直徑，計算菌絲生長速度和抑制率[17]。菌絲生長速度（mm·d-1）=菌落直徑/培養天數；相對生長速度（%）=處理的生長速度/CK的生長速度。

1.7 統計分析

每組試驗重復3—5次，利用Prism（version 8.0）進行數據統計分析。

2 結果

2.1 香菇菌絲生長的最適pH

利用濃度為1 mol·L-1HCL或NaOH將PDA培養基的pH調節到3.0、4.0、5.0、6.0和7.0，分析香菇菌絲生長的最適 pH，結果如圖 1所示，香菇菌絲在pH 3.0—7.0的范圍內都能生長，其中pH 4.0時生長速度最快；當pH＞4.0時，pH越高，菌絲生長速度越慢；CK不含HCL或NaOH，pH為5.5，菌絲生長速度介于pH 5.0和pH 6.0之間。因此，在PDA培養基上，香菇菌絲生長的最適pH為4.0。

2.2 酸化木屑中主要有機酸的種類及含量

圖1 不同初始pH對香菇菌絲生長的影響Fig. 1 Effects of different initial pH on mycelial growth rate of L. edodes on PDA media

利用 GC-MS對酸化木屑和正常木屑中有機酸進行鑒定，樣品中共發現9種主要有機酸，其中草酸、苯甲酸和香草酸可能主要是木屑的成分。乙酸、丙二酸、乳酸、琥珀酸、α-酮戊二酸和檸檬酸可能不僅是木屑成分，也可能是微生物發酵代謝的產物[18-19]，針對這6種有機酸，利用HPLC檢測正常木屑和酸化木屑中的含量，結果表明乙酸、丙二酸、琥珀酸和α-酮戊二酸4種有機酸在兩種木屑中的含量都非常低，無明顯差異；乳酸和檸檬酸在兩種木屑中的差異非常大（圖 2），正常木屑中幾乎檢測不到乳酸和檸檬酸，酸化木屑中乳酸和檸檬酸的含量分別達到（4.6±0.22）mg·g-1和（23±3.35）mg·g-1（按干重計算），推測酸化木屑中的檸檬酸和乳酸主要為堆放過程中微生物發酵代謝產生。

正常木屑樣品和酸化木屑樣品的 pH分別為 6.0和3.0。正常木屑的pH主要與樹種有關，大多數闊葉樹木材的pH為5.0—7.0[20-22]。木屑露天堆放過程中，尤其是碳源充足時，發酵易產生有機酸[2]，本研究樣品中檸檬酸含量達到了23 mg·g-1，足以使pH降至3.0，由此推測酸化木屑 pH的降低主要是微生物發酵代謝產生檸檬酸的結果。

2.3 有機酸和鈣鹽在 PDA培養基上對香菇菌絲生長的影響

5 mmol·L-1乳酸對香菇菌絲生長具有促進作用，25和50 mmol·L-1時具有不同程度抑制作用；而5、25和 50 mmol·L-1的檸檬酸對香菇菌絲生長均有不同程度的抑制作用（圖3）。

碳酸鈣和檸檬酸鈣對香菇菌絲的抑制作用最強，并且濃度越高，抑制越強；乳酸鈣在5 mmol·L-1時無顯著影響，濃度為25和50 mmol·L-1時對香菇菌絲具有一定的抑制作用；硫酸鈣對香菇菌絲無顯著影響（圖4）。

圖2 酸化木屑中主要有機酸的種類Fig. 2 Types of main organic acids in acidified wood chips

圖3 不同濃度有機酸對香菇菌絲生長的影響Fig. 3 Effects of different concentration of organic acids on mycelial growth of L. edodes on PDA media

有機酸和鈣鹽對香菇菌絲的抑制作用非常復雜，可能與鈣離子、pH、緩沖作用和酸根離子等多種因素有關。硫酸鈣對菌絲生長無顯著影響，說明本研究中鈣離子不是影響菌絲生長的主要原因。有機酸使培養基pH下降，如添加50 mmol·L-1檸檬酸或50 mmol·L-1乳酸的PDA 培養基pH分別為2.9和3.2，遠低于最適pH 4.0，菌絲的相對生長速度分別為69.1%和60.1%；檸檬酸鈣和碳酸鈣等堿性鈣鹽使培養基pH升高，如添加50 mmol·L-1檸檬酸鈣和碳酸鈣的培養基pH都為7.0，菌絲的相對生長速度分別為49.5%和31.7%（圖4），說明pH是有機酸和堿性鈣鹽抑制香菇菌絲的一個主要原因。pH 7.0時，碳酸鈣和檸檬酸鈣對菌絲的抑制作用遠高于NaOH，由于碳酸鈣和檸檬酸鈣在 pH 6.4左右具有很強的緩沖作用，推測鈣鹽的抑制作用可能還與緩沖作用有關。

圖4 不同濃度鈣鹽對香菇菌絲生長的影響Fig. 4 Effects of different concentrations of calcium salt on mycelia growth of L. edodes on PDA media

2.4 PDA培養基的緩沖作用對香菇菌絲生長的影響

檸檬酸鈣和碳酸鈣在PDA培養基內有沉淀，為了更準確的檢測緩沖作用對香菇菌絲生長的影響，分別用CBS和PBS調節培養基pH。兩種緩沖液的最適pH都是4.0；pH 4.0時，緩沖液濃度不影響菌絲生長；pH＞4.0時，緩沖液濃度越高，抑制作用越強。當緩沖能力達到一定的閾值，能導致菌種完全不萌發。CBS為25 mmol·L-1時，菌絲在pH 6.0和pH 7.0的PDA培養基上不能萌發；50 mmol·L-1時，菌絲在pH 5.0的PDA培養基上也不能萌發（圖5）。緩沖液濃度越高，緩沖能力越大，由此可見，當偏離最適pH時，培養基的緩沖作用也是影響菌絲生長的一個重要因素。

圖5 緩沖液對香菇菌絲生長的影響Fig. 5 Effect of buffer on mycelial growth of L. edodes on PDA media

2.5 香菇菌絲生長對PDA培養基pH的影響

在菌絲生長過程中，定期檢測PDA培養基pH的變化，結果如圖6所示，添加HCL或NaOH的處理，接種前 pH＞4.0，接種后 pH下降，最終降至pH 4.0左右。添加有機酸的處理，接種前PDA培養基的 pH＜4.0，接種后 pH升高；添加鈣鹽的培養基接種前 pH＞4.0，接種后 pH下降，最終均調節至 pH 4.0左右。由此說明，香菇菌絲對環境pH具有一定的調節能力。當培養基 pH＞4.0時，香菇菌絲通過代謝調節基質pH，最終將基質pH變為 4.0，以利于菌絲的生長。如果培養基中含有緩沖系統，阻礙pH的變化，則抑制菌絲的正常生長。由此可以解釋緩沖液和鈣鹽對香菇菌絲生長的影響機制。

圖6 接種前后PDA培養基pH變化Fig. 6 Changes in pH of PDA media before and after inoculation

3 討論

不同的研究中最適pH并不完全一致，如MARKOVIC等[23]測定的最適pH為3.0—3.63；AMINUDDIN等[24]測定的最適pH為6.0；萬洪善[25]測定的最適pH為5.6。造成這種差異的原因除了所用的菌株和方法不同之外，可能還與香菇調控環境 pH的能力有關。本研究表明當環境pH＞4.0時，香菇菌絲通過分泌草酸降低pH[11,15]，最終將培養基pH調節至4.0，以滿足生長需求。當環境pH＜4.0時，香菇對pH的影響較小，而污叉絲孔菌（Dichomitus squalens）在低pH條件下，草酸脫羧酶和甲酸脫氫酶等基因的表達上調，通過降解基質中的草酸，提高pH[26-27]。香菇菌棒中pH的變化與本研究在PDA培養基的檢測結果一致[6]。不論用HCL-NaOH還是緩沖液調節PDA培養基的pH，初始pH 4.0時，菌絲生長速度最快；并且當pH＞4.0時，隨著菌絲的生長，最終pH均為4.0，由此說明香菇菌絲生長的最適pH為4.0。

目前關于緩沖作用對香菇菌絲生長影響的研究報道相對較少，pH＞4.0時，香菇菌絲產草酸調節培養基pH，緩沖作用阻礙了培養基pH的變化，從而增加了 pH對香菇菌絲生長的影響。本研究中，當緩沖作用達到一定的閾值，pH 5.0—7.0的范圍內，緩沖液可能完全抑制香菇菌絲的生長，導致菌種不萌發。生產中，木屑發酵產生有機酸，用石灰調節pH時形成有機酸鈣，如果鈣鹽在pH 5.0—7.0范圍內具有緩沖作用，則可能抑制香菇菌絲的生長。檸檬酸鈣和碳酸鈣在 pH 6.4左右具有較強的緩沖作用，在PDA培養基上能顯著抑制香菇菌絲的生長；乳酸的pKa=3.86，乳酸鈣在pH 5.0—7.0范圍內的緩沖作用較弱，其在PDA培養基上的抑制作用也相對較弱。由此可見，生產中調節培養料的 pH時，不僅要考慮pH，還要考慮培養料內各種成分的緩沖作用。

有機酸對食用菌菌絲生長具有一定的影響。檸檬酸能促進杏鮑菇（P. eryngii）、金針菇、雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）和黑柄炭角菌（Xylaria nigripes）的菌絲生長[28-31]；乳酸能抑制杏鮑菇和平菇菌絲生長[17]。本研究中，除5 mmol·L-1的乳酸輕微促進香菇菌絲生長外，其他濃度的乳酸和檸檬酸均抑制香菇菌絲生長。有機酸的影響機制可能與 pH和有機酸根離子兩個方面有關，檸檬酸和檸檬酸鈣對香菇菌絲都有抑制作用，pH 4.0時，50 mmol·L-1的檸檬酸緩沖液不影響菌絲生長，說明本研究中檸檬酸根離子不是影響香菇菌絲生長的主要原因，檸檬酸對香菇菌絲的抑制作用主要與pH有關。

4 結論

香菇菌絲能夠在pH 3.0—7.0的范圍內生長，最適pH為4.0。當pH＞4.0時，香菇菌絲生長過程中通過代謝降低環境pH，如果培養基中含有阻礙pH調節的緩沖系統，則抑制香菇菌絲的生長；當緩沖能力達到一定的閾值，可導致菌種完全不萌發。