circRNA 103809通過miR-620/GPC5通路抑制肝癌細胞系增殖的分子機制

黎昕 龍官寶 趙新陽 張俊 肖超文

(華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院肝膽胰外科，湖北 武漢 430014)

肝細胞癌是常見的高死亡率原發性惡性腫瘤，盡管臨床上采用了許多治療策略，但是肝癌患者的5年生存率仍然很低〔1〕。目前尚無有效的治療方法，預防和早期診斷是治療肝細胞癌的理想方法，需要尋找有效的生物標志物用于肝癌的預后和預測。過去幾十年，非編碼RNA如microRNA、長鏈非編碼(lnc)RNA在肝癌中的作用被廣泛研究，然而環狀(circ)RNA在肝癌中的表達及其作用機制尚不清楚。circRNA是一類新的非編碼RNA，在真核基因表達中起關鍵調節作用，其特征為3′和5′剪接位點之間形成共價連接，即反向剪接。circRNA現在被認為是編碼序列的重要調控因子，在腫瘤發生發展中起關鍵作用〔2〕。以往的研究已證實環狀RNA-103809/小微RNA-620(circular RNA-103809/miRNA-620, circRNA-103809/miR-620)通路參與到肝癌細胞增殖〔3〕，然而并沒有闡述miR-620作用的下游。已有研究表明，miR-620可以調控GPC5參與肺腺癌的發生發展〔4〕。近年來，除了肺腺癌，GPC5還被證實參與到乳腺癌〔5〕、淋巴瘤〔6〕、胃癌〔7〕、前列腺癌〔8〕和腎病綜合征〔9〕等多種疾病之中。本研究擬分析circRNA-103809/miR-620/GPC5在肝細胞癌中的作用機制，為肝細胞癌的治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1Hep-3B細胞培養與轉染 人肝細胞癌細胞系Hep-3B和正常肝細胞系LO2購于中國科學院上海細胞所。Hep-3B細胞使用含10%胎牛血清(Cat.10082-147，Gibco)和1%青霉素/鏈霉素(Cat.No.15140-12，Invitrogen)的RPMI1640培養基(Invitrogen)，于5%CO2的37℃培養箱中培養。LO2使用DMEM培養基(Invitrogen)，其他條件與肝細胞癌細胞系培養條件相同。細胞接種于6孔板中，按照說明書步驟使用LipofectamineTM2000 (Invitrogen)進行轉染實驗，circRNA-103809過表達質粒、circRNA-103809 siRNA、miR-620 mimic、miR-620 siRNA、GPC5的siRNA對照購于GenePharma。

1.2實時熒光定量(qRT)-PCR 使用Trizol(Invitrogen)按照說明提取總RNA并測濃度，TaqMan MicroRNA逆轉錄試劑盒(Applied Biosystems)進行miR620逆轉錄，第一鏈逆轉錄試劑盒(Takara)進行circRNA、GPC5逆轉錄。使用SYBRs GREEN PCR Master Mix (Applied Biosystems)在ABI7500實時PCR系統(Applied Biosystems)完成qRT-PCR擴增，使用ΔΔCT 法進行分析。GAPDH為circRNA、GPC5的內參，U6為miRNA內參。circRNA-103809正向引物：5′-AAAGAGTTTTTGGAAGACGTC-3′；反向引物：5′-TGGTGGCATGTTTTGTCATT-3′。miR-620正向引物：5′-ACACTCCAGCTGGGATGGAGATAGATA T-3′；反向引物5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGATTTCTAT-3′。GPC5正向引物：5′-A GACCACCACAAGGAACAGTG-3′；反向引物：5′-AGACTGGGCTTTGA TTCCATT-3′。GAPDH正向引物：5′-TATGATGATATCAAGAGGGTAGT-3′；反向引物：5′-TGTATCCAAACTCATTGTCATAC-3′。U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3′，反向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3′。

1.3Western印跡 使用RIPA裂解液(Solarbio)提蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒(Solarbio)濃度。10%十二烷基硫酸鈉(SDS)/聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白質，并將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜。3%BSA室溫孵育30 min，4℃一抗(anti-GPC5：ab107493，1∶500，Abcam；GAPDH：ab9485，1∶2 000，Abcam)孵育16 h，TBST洗3遍，二抗(800R/800M，1∶10 000，Odyssey)室溫孵育1 h，TBST洗3遍后，使用Odyssey紅外成像系統檢測。

1.4細胞增殖試驗 使用CCK-8(Dojindo)測定細胞活性。將細胞接種到96孔板(5 000/100 μl)，每孔加入10 μl CCK-8，37℃孵育2 h，酶標儀(Bio-Rad)在450 nm測定吸光度。

1.5集落形成試驗 細胞接種在6孔板(500個/孔)37℃培養14 d，4%多聚甲醛固定，0.5%結晶紫染色，計數包含至少50個細胞的集落數。

1.6統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、SNQ檢驗，采用Graphpad prism8進行圖制作。

2 結 果

2.1Hep-3B中circRNA-103809、mi-RNA620、GPC5表達水平 對照組的LO2細胞circRNA-103809相對表達量為1.000 0±0.079 20，Hep-3B細胞中circRNA-103809低表達，其相對表達量為0.231 4±0.021 80。對照組的LO2細胞miR-620相對表達量為1.000 0±0.063 2，Hep-3B細胞中miR-620高表達，相對表達量為5.578 3±0.378 5。對照組的LO2細胞GPC5相對表達量為1.000 0±0.089 2，Hep-3B細胞中GPC5低表達，相對表達量為0.331 4±0.054 4。通過Western印跡檢測蛋白水平，Hep-3B細胞中GPC5表達量(0.533 2±0.076 2)明顯低于LO2細胞(1.000 0±0.089 2，P<0.05)，見圖1，推測在肝癌細胞中GPC5處于miR-620下游。

圖1 Western印跡檢測LO2、Hep-3B細胞系GPC5表達量

2.2Hep-3B中miR-620通過調控GPC5影響細胞增殖 為了驗證GPC5處于miR-620下游的猜想，用miR-620的siRNA質粒轉染Hep-3B細胞，轉染48 h后檢測GPC5蛋白水平。在Hep-3B細胞中，轉染miR-620的siRNA后GPC5的表達水平(1.778±0.096)是對照組(1.001±0.093)的1.776倍(P<0.01)，而共轉miR-620的siRNA與GPC5的siRNA，GPC5的表達水平(1.446±0.097)比單轉miR-620 siRNA組下調(P<0.01)(圖2)。

圖2 各組GPC5蛋白表達

在0 h、12 h、24 h、48 h、72 h檢測細胞活力，miR-620 siRNA組的細胞增殖活性相比于對照組均降低，72 h時，miR-620 siRNA組細胞活性為對照組的50.3%(P<0.01)。共轉組比單轉組細胞活性上升(P<0.01，表1)。miR-620 siRNA組的集落計數相比于對照組減少，為對照組的48.6%(P<0.01)。共轉組比單轉組集落數增加(P<0.01)見圖3。證明GPC5在肝癌細胞中受到miR-620反向調控，降低miR-620的水平可以引起GPC5水平上升，并抑制肝癌細胞的增殖。

表1 Hep-3B中miR-620通過調控GPC5影響細胞增殖

圖3 各組細胞集落形成(結晶紫，×200)

2.3Hep-3B中circRNA-103809調控miR-620/GPC5影響細胞增殖 過表達circRNA-103809發現GPC5的表達水平(1.608±0.092)為對照組(1.003±0.082)的1.60倍(P<0.01，圖4)。同時過表達circRNA-103809和miR-620時，GPC5水平(1.203±0.086)比單過表達circRNA-103809下降(P<0.01，圖4)。用CCK-8檢測細胞增殖情況，過表達circRNA-103809使細胞增殖活性降低，共同過表達時細胞增殖活性有所恢復。72 h時，過表達circRNA-103809后細胞活性為對照組49.7%(P<0.01)，而共同過表達組比單過表達組，細胞活性上升，見表2。過表達circRNA-103809組的集落計數相比于對照組減少，為對照組25.80%(P<0.01，表2)。共轉組比單轉組集落數增加(圖5)。

圖4 Hep-3B中circRNA-103809調控miR-620/GPC5表達

表2 Hep-3B中circRNA-103809調控miR-620/GPC5影響細胞增殖

圖5 Hep-3B中circRNA-103809調控miR-620/GPC5對細胞集落的影響(結晶紫，×200)

3 討 論

近年來，已有研究指出，GPC5與多種腫瘤發生發展相關。GPC5是Glypican基因家族的成員，可編碼細胞表面蛋白聚糖。迄今為止，哺乳動物中已經鑒定出了六種Glypican家族成員(GPC1-6)，它們在調節腫瘤生長、分化和遷移等方面起著不同的作用。GPC5在淋巴瘤過表達，誘導細胞增殖。但是在肺腺癌、乳腺腫瘤中發現了GPC5的水平降低，并且其下調有助于非吸煙者肺癌的發展，這表明GPC5可能是肺癌和乳腺癌的潛在抑制基因。miRNA-620可調控GPC5參與到肺腺癌的發生發展中。根據我們的研究，circRNA-103809通過調控miRNA-620在肝癌細胞的增殖、遷移等過程中起作用。因此我們想探究在肝癌細胞系中GPC5是否是miR-620的下游靶基因，并通過circRNA-103809/miRNA-620/GPC5這一條通路在細胞增殖中起作用。本實驗表明在肝癌細胞系Hep-3B中，circRNA-103809可以通過下調miRNA-620的水平，進而提高GPC5的水平，以抑制腫瘤細胞的增殖。miRNA-620和GPC5都可以作為肝癌治療的潛在靶點。此外，我們也在開展動物實驗進一步驗證這一條通路的體內水平對肝癌的作用。